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1、【教育类精品资料】,补充,载体DNA用Bam H切割,同一限制酶切位点连接,Bam H切割反应,载体DNA用Bam H切割,目的基因用 Bam H切割,T4 DNA连接酶15C,议一议,2、能否用SARS病毒作为基因载体？,3、作为载体，若没有切割位点将怎样？,4、携带目的基因的载体是否进入了受体细胞，如何鉴定？,5、假如目的基因导入受体细胞后不能复制，将怎样？,1、从化学本质来看，载体应该是什么？,双链DNA,不能,不能进行DNA的重组,载体上应有标记基因,可能造成基因丢失,“噬菌体的衍生物”的解释 由于野生型噬菌体DNA对大多数目前在分子克隆中常用的限制酶有多个切点，而且有些位点恰巧定位于
2、与噬菌体生长繁殖关系密切的必需基因之中，这些位点的剪切重组必然严重影响噬菌体的繁殖。因此野生型DNA不能直接用作载体而需经过改造才能成为有价值的克隆载体。天然噬菌体载体改造的关键是去除或改变其基因组必需区段内多余的限制酶切位点。改造方法包括点突变、基因组的置换和缺失。由天然噬菌体改建获得的就是噬菌体的衍生物。,p7,思考与讨论：1。提示：不能。因为一般基因有上千个碱基对2.提示：可能是剪切位点或连接位点选得不对（也可能是其他原因）,补：原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其
3、结合。,转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。,转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。,不能转录为信使RNA，不能 编码蛋白质。,：能转录相应的信使RNA，能 编码蛋白质,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上 游的RNA聚合酶结合位点。,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,启动子,终止子,补：真核细胞的基因结构,编码区,与RNA聚合酶结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子,启
4、动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子：,外显子：,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点。,非编码序列：,包括非编码区和内含子,编码区,与RNA聚合酶结合位点,内含子,外显子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,2.基因文库的构建方法,供体细胞中的DNA,许多DNA片段,运载体,限制酶,与载体连接载入,受体细胞,产生特定性状,导入,外源DNA扩增,目的基因,分离,(一)从基因文库中获取目的基因,一、目的基因的获取,基因工程的基本操作程序,鸟枪法(直接分离法)
5、,以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,目的基因的mRNA,单链DNA,反转录酶,DNA聚合酶,双链DNA(目的基因),2.基因文库的构建方法,(一)从基因文库中获取目的基因,一、目的基因的获取,基因工程的基本操作程序,反转录法,根据已知的氨基酸序列合成DNA法,根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,(一)从基因文库中获取目的基因,一、目的基因的获取,基因工程的基本操作程序,上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？,操作简便广泛使用,工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因,专一性强,操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高,专一性最强,仅限于合成核苷酸对较少的简单基因,
