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1、Chapter five vectors,Agriculture university of Hebei Province,载体的概念：载体是基因工程中携带目的基因进入宿主细胞，可自我或随同宿主DNA的复制而复制，及表达的工具。载体的条件：含有复制子：这是一段具有特殊结构的DNA序列，载体有复制起始位点，才能携带外源基因进入宿主后，进行复制，保证子代细胞仍含有外源基因。有一个或多个利于检测的遗传表型，易于识别和筛选。如抗药性、显色表型、营养缺陷型、荧光表型等.有一个或几个限制性酶切酶的单一识别位点，便于外源基因的插入。适当的拷贝数。高拷贝数不仅利于载体的制备，也有利于克隆基因的剂量的增加。载体
2、的分类：质粒载体可容纳15KB的外源片断 噬菌体载体2545KB 人工染色体45KB以上,质粒是一种可进行自我复制的并能独立传播的DNA的一种存在形式，并且自然界中原核生物、真核生物大部分都发现有质粒的存在，所以质粒现在是应用最广的载体,plasmids,Section one,一、质粒的生物学特性：,质粒最初发现于细菌中，是染色体外能自主复制的双链共价闭合的环状DNA分子，是能够进行独立复制并保持遗传恒定的复制子，大小在1200KB。质粒常含有一些编码对细菌生存有利的基因，比如说抗性基因，降解复杂有机物的酶、细菌素，并且可赋予微生物特殊的外形鞭毛、菌毛、芽孢等。,如:大肠杆菌中的F质粒、R质
3、粒、COL质粒。F质粒：又叫性质粒，他的存在决定大肠杆菌的性别，含有F因子的菌株有一个特殊的结构性菌毛。R质粒：又叫抗性因子，他们含有一种或几种抗生素的抗性基因，编码一些酶类，可对抗生素进行修饰和降解。这样一旦微生物具有了抗性质粒，就出现对抗生素的抗性。19591960年日本人发现了抗药性因子。另外除了抗药特点外，有的质粒具有抗砷、汞、银等重金属的特性，有的抗紫外等射线。COL质粒：1952年发现的大肠杆菌含有这一因子可编码一种奇怪的蛋白质抗菌物质大肠菌素。,如何识别微生物是不是含有质粒？首先要看微生物的形态（同种微生物形态不同，可能含有），其次要从细胞中提取质粒。如荧光假单孢菌。具有质粒的均
4、有分泌抗生素的特性。,二、质粒的遗传学特性：,1.质粒DNA闭合的环状分子：迄今发现的大部分质粒都是环状分子，也有线性的。质粒分子三种存在形式：（主要与复制有关）共价闭合超螺旋形式：（covalently closed circular，简写cccDNA）开放环结构：一条保持着完整的环结构，另一条有一个或数个切刻。线性结构：质粒在限制性酶作用下，双链断裂，形成线性，又叫L型。克隆只有超螺旋可用。,2.cccDNA分子分离特性：,由于cccDNA分子团压成一个紧密的结构，当我们用EBr、丫啶橙染料分子作用后，线性分子染料插入的分子个数多，cccDNA插入的分子个数少，密度大，所以沉降系数大，进行
5、密度梯度离心时可将其分开,cccDNA在较高高的温度和PH值条件下才会变性，（较线性和开放环结构的DNA），如果变性，由于团在一起，条件恢复后，会很快复性，形成cccDNA，线性和环状的变性后，复性会形成杂乱的大分子团状结构，从而从体系中沉淀下来。,3.质粒DNA的分子量和拷贝数：,按质粒的分子量大小，可分为量大类：37kb，拷贝数多；70150kb，含有与质粒功能有关的更多基因，可自我传递（可编码一套控制质粒DNA转移的基因，所以可从一个细胞转到另一个细胞），如果一个细胞含有这种质粒，他可以带动小质粒进行传递转移。这种质粒的拷贝数低。,拷贝数是受一个定位在叫cop基因编码的阻遏物的控制，质粒
6、个数增加，合成的阻遏物的浓度增加，从而阻止质粒的进一步合成。不像病毒DNA进行无限制的合成，直到细胞裂解。,4.质粒DNA的复制类型：,根据质粒复制所受控制的方式和在寄主细胞所含质粒拷贝数的多少：松弛型：质粒的复制可自由完成，自身可编码与复制有关的功能蛋白，所以在细胞的生命周期中，可随时进行自我复制，所以松弛型的拷贝数多，每个细胞中由10200个不等。严紧型：质粒的复制的启动，受寄主细胞的复制起始蛋白的调控，复制起始蛋白是细胞在进行DNA复制时产生的，所以严紧型质粒的复制是宿主细胞进行染色体复制时才能进行复制的质粒，依赖于宿主细胞，自身不能合成复制起始蛋白。他随染色体可平均分配到子细胞中。拷贝
7、数少12个。,5.质粒的提取与纯化：,原理：理想的状态是细胞裂解后，大部分DNA释放到裂解液中，根据共价闭合环状的质粒DNA在pH12-12.5时，线性DNA会完全变性，而共价闭合环状的DNA只是氢键断裂，酸中和后，共价闭合环状的DNA迅速准确地复性，而线性DNA聚合成网状结构，与变性的蛋白和RNA一道离心沉淀，上清液中的质粒DNA用乙醇沉淀出来。,第一步：（1）在5m1含相应抗生素的LB培养基中接种一单菌落，于37剧烈振荡培养过夜。（2）将1.5m1培养物倒入Eppendorf管中，用微量离心机于4以12000rpm离心30秒。（3）吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。（4）将细菌沉淀重悬于1
8、00l用冰预冷的溶液I中（溶液：50mmolL 葡萄糖，25mmolL TrisCI(pH 80)，10mmolL EDTA(pH 80，溶菌酶45mg，酶作用环境由缓冲液提供)。剧烈振荡。须使细菌沉淀在溶液中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触，室温静止530min，细胞壁降解。,第二步：加200l新配制的溶液（现用现配）（0.2molL NaOH，1 SDS）盖紧管口，快速颠 倒离心管，以混合内容物冰浴5min。SDS破坏原生质体，然后DNA变性。时间是关键：长了变性不可逆，短了DNA没有变性。此时的现象应为变得澄清，和鼻涕一样粘。第三步：加150l用冰预冷的溶液（5molL乙酸钾
9、60ml，冰乙酸 11.5ml，pH为4.8）。盖紧管口，温和地振荡10秒钟使溶液在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上35分钟。中和作用使DNA形成网状的聚合物，高浓度的乙酸钾会引起蛋白质SDS复合物变性和大分子RNA共同沉淀。,最后：4 12000rpm离心10分钟，将上清转移到另一离心管中，上清中是质粒DNA。加等体积氯仿，振荡混匀，412000rpm离心10分种，将上清转移到另一离心管中。用2倍体积的无水乙醇沉淀双链DNA。温和振荡混匀，于-18放置20分钟。用微量离心机于4以12000rpm离心10分钟。弃上清，加入70%冷乙醇洗沉淀1-2次真空干燥DNA沉淀后，将其溶于TE
10、溶液中。,6.影响质粒产量的因素：,寄主自身的遗传背景：质粒一般都保藏在质粒中，所以质粒的稳定性直接与寄主的特性有关，我们在基因工程中采用的寄主细胞都是经过人为改造过得微生物，如JM110，JM109、XL1-Blue等，这些菌株的end基因均发生了突变，end基因负责编码核酸内切酶I，突变后，菌株就失去了编码能力，从而保证了质粒在宿主细胞中稳定存在。所以，我们要想获得大量的质粒DNA，最好不要选择野生型菌株作为宿主细胞。,质粒的拷贝数：分子的多与寡是决定产量的重要因素。pBR322 拷贝数大于25个 产量0.23ug/ml ColE1 15个 0.11 ug/ml 基因克隆尽量选择松弛型质粒
11、，如果是严紧型要进行质粒复制子改造。质粒的大小：通常质粒越大，拷贝数也越少，所以我们在进行基因重组时，首先要选择分子量小的质粒，其次质粒分子量大的要使外源基因的片断长度合适，不要过大。,三、质粒载体的构建,天然质粒存在着不同程度的局限性，不能直接作为基因克隆的载体，必须进行改造。便于转化、筛选。质粒的构建有三个方面：1.引入易于检测的选择性标记，去掉质粒的非必需序列：最早使用的质粒载体只有一个选择性标记：抗性基因（一个标记有局限性：无法知道外源基因是不是转化进入宿主细胞，因为空载体也可使菌株产生抗性）。,第一个经改造的认为较完善的质粒载体是pBR313,他是松弛型载体，引入了两个标记基因-抗四
12、环素基因Tecr和抗青霉素基因Ampr,他的外源基因插入位点在两个抗性基因中,质粒的序列含有必要区和非必要区。必要区指的是与质粒DNA复制有关的基因，他们对质粒的存活、复制极为重要。非必要区里存在着影响细胞性状的基因，编码产生特殊的物质，另外还有一部分质粒片断至今不知其功能。必要和非必要区各自独立，所以我们可以把非必要区去除，只留下必要区。,2.调整质粒载体的结构，引入多克隆位点：新型载体都引入了一个人工合成的由多种常用限制性内切酶单一识别位点组成的序列，叫多克隆位点（multiple cloning site,MCS）。,3.引入多种用途的辅助序列，构建具有特化功能的载体：构建质粒可用于组织
13、化学方法的鉴定：pUC18载体带有一个Lac操纵子的DNA区段，宿主细胞具有与之互补的基因，当质粒进入宿主后，由于互补作用，而实现半乳糖苷酶的表达（诱导物与阻遏蛋白结合，阻遏蛋白与操作子脱离）。外源基因的插入会导致基因失活而检查重组子。,构建可对重组克隆进行选择的质粒载体，这种质粒载体具有直接选择标记并可赋予寄主细胞相应的表型（荧光蛋白）。构建含有强启动子的表达型质粒载体，很多质粒载体在多克隆位点的临近位置上带有外源启动子，插入的外源基因可以表达相应的蛋白质。,四、典型的质粒载体,1.pBR322：pBR322是按照标准的载体命名原则命名，p表示质粒plasmid，BR分别是质粒的两位构建人b
14、olivar和rodriguez,322指实验室编号。,优点：具有较小的分子量:经验表明为了避免DNA分子在纯化过程中发生链的断裂，克隆载体最好不要超过10kb，pBR322不仅易于分离纯化，而且即使克隆一段大小达6kb的外源DNA后，其重组体分子的大小仍符合这一条件。有两种抗生素抗性基因，可作为转化子的选择性标记。当我们把目的基因插入到抗性基因内部，抗性基因就会失去活性，即不能进行抗性蛋白物质的合成，就为我们筛选提供一种标记。,具有较高的拷贝数，我们用氯霉素（壮观霉素）处理后，质粒的个数可达1000个。氯霉素可以抑制染色体DNA的复制（氯霉素可抑制核糖体的活性），所以当我们对培养的菌体用氯霉
15、素处理，松弛型质粒的复制起始功能蛋白稳定，所以可以继续合成质粒，而宿主的复制起始蛋白不稳定，半衰期短，所以细胞在不能分裂的情况下，质粒仍能复制，最后达到相当高的水平。,2、pUC质粒载体：,pUC质粒载体：是由美国加利福尼亚大学的专家构建的。是在pBR322质粒载体的基础上，组入了一个带有多克隆位点的LacZ基因，而发展成为具有双功能检测特性的质粒载体。,最常用的克隆载体，优点：具有更小的相对分子量和更高的拷贝数。在构建pUC质粒载体时仅留下pBR322的复制起始起始位点和AMP抗性基因，分子大大减小，他的拷贝数可以达到500700个/个细胞。适合组织化学法检测重组子。有利于检测具有多克隆位点
16、，便于片断的插入。,3、表达载体：4、穿梭质粒载体：,指的是一类由人工构建的具有两种不同复制起始位点和选择标记可在两种不同的寄主中存活和复制，并可携带外源基因在不同物种的细胞之间往返穿梭的质粒载体。他们可以使得质粒可在不同宿主间进行基因的转移，研究在不同的细胞中的克隆、表达的调控功能。目前像大肠杆菌枯草芽孢的穿梭质粒，大肠酿酒酵母，大肠动物等。,五、质粒载体的不稳定性：,1.分离的不稳定性：是指在细胞分裂过程中，有一个细胞没有获得质粒DNA，最终增值成为无质粒的菌株，这种菌株由于没有代谢压力而具有较快的生长速率，在体系中成为了优势菌群，最后导致质粒的丢失，这种现象叫质粒分离的不稳定性。对于天然
17、质粒来说，他们的基因中含有控制质粒分配的功能区，细胞分裂构成中，这个功能区保证质粒拷贝被平均分配。人工构建的质粒这个功能区已经缺失，因此，它在细胞分裂中是随机分配的，尽管出现无质粒的细胞的几率较低，但在一定的条件下，比如细胞分裂较快或营养缺乏的情况下，会出现无质粒的细胞。,解决办法：施加选择性压力（抗生素培养基培养）。,结构的不稳定性：质粒分子带有外源基因，外源基因有时会与宿主DNA进行同源重组，另外，一些诱变作用会产生外源DNA的缺失、插入、重排，再有寄主染色体的转座子也会使基因插入失活。这些因素会引起质粒的结构不稳定。,解决办法：功能性基因突变,Vector of phage,Sectio
18、n two,1974年，Davis发现噬菌体失去一部分DNA后，仍然不失活，这一部分缺失DNA的空间正好用来承载外源基因片断，第一次证明了噬菌体DNA作为基因无性繁殖载体的可能性。噬菌体载体和外源基因重组后，可以随寄主细胞一道复制和增值，在溶源周期，可整合到宿主染色体上，这是噬菌体载体作为基因工程载体的以发展重要特征。,一、噬菌体的DNA结构特征：,噬菌体的基因组是一条线性DNA，DNA分子两端各有一个由12个核苷酸组成的互补的5突出的黏性末端，所以，这种线性分子可以发生环化，形成闭合的环状分子，这个位点成为cos 位点，即黏性末端。环化状态下，噬菌体DNA分子的长度是48502bp,定位着6
19、1个与噬菌体生活相关的基因，这些基因聚集成促，控制着噬菌体头、维、复制、重组四大功能。,二、噬菌体载体的构建：,野生噬菌体DNA不适于用作基因克隆，改造集中于两个方面：1、消除多余的限制性内切酶切割位点：噬菌体DNA作为载体来说，突出的缺点是对大多数常用的核酸限制性内切酶都具有过多的限制性切点，而其中有的切点在基因组的必要区。所以我们要对它进行改造，改造可通过点突变，序列置换及缺失。2、去除噬菌体DNA中的非必要区：经过测定，噬菌体DNA中有一半参加噬菌体的生命活动，即有50的基因对噬菌体的生长和噬菌斑的形成是必须的。而另一部分基因当他们被外源基因取代后，并不影响噬菌体的生命功能。因此，可以利
20、用置换和缺失去除噬菌体DNA中一些非必要区，使他能拼接不同长度的外源DNA片断。噬菌体载体有一个系列，分别可容纳922kb的片断。（噬菌体装配的要求是重组的DNA分子要保证在36.450kb才能进行装配），所以对于大片断不能采用噬菌体载体。,三、噬菌体载体的作用：,噬菌体侵染宿主后，有两个途径：溶源途径：当DNA进入宿主细胞后，整合到染色体上，随着宿主染色体复制而复制。裂解途径：当DNA进入宿主细胞后，形成环状DNA，进行滚环复制，并合成头/尾。然后切割，包装、释放。溶源性在特殊的条件下可实现向裂解途径的转变。我们可以以噬菌体DNA作为载体，通过外源基因体外重组、病毒的体外包装（有试剂盒），制造出成熟的含有外源基因的病毒颗粒，去感染大肠杆菌，发生溶源性结合，然后通过大肠杆菌的增殖使含有外源基因的大肠杆菌的数量不断增加，同时采用选择性压力富集含有外源基因的菌株，（可不讲:最后通过特殊条件诱导，溶源途径转变为裂解途径，噬菌体大量繁殖，产生噬菌斑，通过杂交进行目的基因检测。）,Thank You!,
