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1、2.基因工程药物的生产,3.基因工程药物的检验,第九章基因工程药物,1.无性繁殖系的组建,1.1 人胰岛素工程菌的组建,1.2 人2b型干扰素工程菌的组建,1.3 集落刺激因子工程菌的组建,(1)胰岛素的结构及其生物合成,1.1人胰岛素工程菌的组建,(2)人胰岛素的生产方法:,A.化学合成法制人胰岛素 根据人胰岛素A链和B链的序列，由单个氨基酸从头合成。技术可行，但其生产成本奇高。,B.化学转型法制人胰岛素 猪胰岛素与人胰岛素只在B链的C末端有一个氨基酸的差异，猪的为Ala，人的为Thr，可将猪胰岛素在体外酶促转化为人胰岛素。但工艺复杂，产品的价格不菲。,C.基因工程法制人胰岛素 1982年，
2、美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素，成为世界上第一个上市的基因工程药物。由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外胰岛素受体结合性能、降血糖作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别。,a.A链和B链分别表达法：,由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配对率较低，通常只有10%20%,采用这条工艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以上。,b.人胰岛素A链和B链同时表达法：,c.人胰岛素原表达法：,由于C肽的存在，胰岛素原能形成良好的空间构象，三对二硫键的正确配对率也相应提高，折叠率高达80%以上，每克最终产品的成本仅50美元。,1.2 人
3、2b型干扰素工程菌的组建,(1)人2b型干扰素基因的获得：应用PCR的方法，从人的染色体片段获得。,(2)重组表达质粒的特点：具有双SD序列。抗病毒活性高,构建过程见书P172图9-2,1.3 集落刺激因子工程菌的组建,(1)RT-PCR法制备GM-CSF cDNA,从正常人血中分离出单核细胞，提取总RNA；引物设计：引物：5端增加有EcoR酶切位点，起始密码子，个组氨酸密码子和凝血酶切位点引物：5端加一个终止密码子和一个BamH酶切位点,PCR扩增产物和质粒pBV220双酶切后,重组连接，挑选氨苄青酶素抗性转化子，经酶切筛选、鉴定，阳性重组子命名为pGM09,(2)GM-CSF重组表达载体的
4、构建,(1)rhG-CSF基因工程菌的培养与发酵,1)发酵用工程菌种的筛选,将保存的菌种接种到LB琼脂平板上，过夜培养。挑取单菌落进行液体培养，取少量经热诱导培养后，用SDS-PAGE分析选取表达量最高的克隆作为发酵用种子,2)发酵培养基的选用,将工程菌接种于种发酵培养基中进行发酵，比较诱导表达结果及收菌量，选取合适的发酵用培养基,2.基因工程药物的生产,2.1 基因工程菌的培养与发酵,3)接种量对发酵的影响,以10或15接种量较适宜,4)溶解氧水平对发酵的影响,5)pH对工程菌生长和表达的影响,前期培养着重工程菌的生长：后期培养着重外源蛋白的表达：,6)热诱导对表达量的影响,热诱导表达的工程
5、菌一般在菌体的对数生长期或对数生长后期，在2min内温度突然升高10 以上。,7)高密度对表达量的影响,高表达的前提下，适当提高菌体密度。,高水平溶解氧(40)有利于外源蛋白的形成.,(2)IFN-2b基因工程菌的培养与发酵工程菌株:SW-IFN2b/DH5工程菌的种子培养:将工程菌接种在LB培养基中，30振摇培养10h.工程菌的发酵:接入种子培养液至发酵罐中，30发酵h，然后在42诱导h完成发酵。,2.2 基因工程药物的分离纯化,(1)影响分离纯化的主要因素,产物活性、纯度和杂质产物表达形式和表达水平产物本身的分子特性产物的用途和需求量,(2)各种表达形式的分离纯化方法,包涵体的分离纯化方法
6、,A.菌体细胞的收集与破碎：采用物理、化学和酶学三种方法进行破碎B.包涵体的分离、洗涤与溶解：通过离心分离；TE缓冲液反复洗涤；用尿素、盐酸胍、SDS等溶解.C.变性蛋白质的纯化：采用的方法有凝胶过滤、离子交换层析和 高效液相色谱等。D.重组蛋白质的复性：适当条件使其重新折叠。,例：rGM-CSF的分离纯化,3.1 基因工程药物的质量控制,(1)与传统药品生产的区别,利用活细胞作为表达系统，产品为蛋白质，具有复杂的分子结构 产品的制备过程中，药物容易发生变化 参与人体的生理调节作用，极微量就可产生显著效应，在性质或剂量上不能有任何偏差,因此，必需要严格控制药品质量，确保产品安全有效。,3.基因
7、工程药物的检验,(2)基因工程药物的特点,分泌量极低而生理药理活性极高具有细胞和组织特异性多数细胞因子具有多功能性细胞因子间存在复杂的相互作用具有低免疫原性,(3)基因工程药物的质量要求,A.提供表达体系及工程菌的详细资料。B.提供培养方法，纯化方法、除去微量杂质的 方法等。C.要求进行理化鉴定，包括产品的特征、纯度 及与天然产品的一致性。D.要求进行外源核酸和抗原检测E.与天然产品进行生物活性或效力试验的比较F.进行动物毒性试验G.要有足够的对人体的安全性资料H.必须经过临床试验，以评价其安全性和有效性。,(4)基因工程药物的质控要点,1)原材料的控制：表达载体和宿主细胞克隆基因的序列2)生
8、产的控制：原始细胞库有限代次的生产连续培养生产分离纯化,(5)终产品的质量控制,方法：电泳法、免疫学分析法、受体结合试验 和高效液相色谱法等内容：氨基酸成分分析、肽图分析、蛋白质 浓度及分子量测定、蛋白质二硫键分析,1)产品的鉴定：,2)纯度分析：,目的蛋白质的含量测定,产物杂质检测,宿主细胞蛋白、病素和细菌等微生物、热原质、内毒素、致敏原及DNA等,3)生物活性测定：,4)安全性评价：,5)稳定性考察：,6)产品一致性的保证：,体内生物活性测定：根据目的基因产物的 生物学特性，建立适合的生物学模型体外生物活性测定：细胞培养计数法等,除一般安全性要求外，还要根据基因工程产品本身的结构特性，进行
9、某些药物动力学和毒理学研究。,对纯度、分子特征和生物学效价等多方面进行综合评价,(6)基因工程药物的制造及检定规定,符合中国生物制品规程的各项规定,2)制造：,3)检定,1)定义、组成及用途,A.基本要求：设施、原料、生产用水、生产用具B.工程菌菌种的要求：菌种的名称；种子批建立、传代及保存；菌种鉴定；C.原液的制备及检定：种子液及发酵液的制备及条件；发酵液的处理；初步纯化及高度纯化D.半成品配制、分批：先稀释除菌，再分批E.另对分装、冻干、规格、包装等均进行了规定,3.2基因工程药物常用的检验方法,(1)化学检定法Lowry法、电泳法、高效液相色谱法等,(2)肽图分析法每一种蛋白质的肽图谱具
10、有特异性、专一性。银染SDS-PAGE微量肽图法：CNBr裂解较大肽片段RP-HPLC法：胰蛋白酶裂解有肽段,(3)外源DNA残留量的测定杂交分析,(4)宿主细胞蛋白杂质的检测 点免疫结合测定,兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体(10g/ml),置酶标板内,4过夜,洗板三次,加牛血清白蛋白,置372h封闭,稀释菌体蛋白成浓度梯度,稀释待检样品至250g/ml左右,洗板三次,将配备的标准和待检样品加至板内,置372h,将HRP酶联抗抗体,加至板内,置371h,洗板十次,加入底物,置3740min,加入终止液终止反应,放入酶标仪中进行结果分析,(5)无菌试验,1)抽样:原液及半成品:每瓶分别进行,抽样量0.
11、1%,10ml 成品:每亚批随机抽样试验,抽样量与成品数量有关,2)检查方法：a.直接接种法 b.薄膜过滤法,3)结果判定：适当培养基中培养不少于14天 无菌生长：合格 有菌生长：复试，样品加量进行 有菌生长：不合格 无菌生长：合格,(6)内毒素试验鲎试剂凝胶法：鲎试剂与细菌内毒素产生凝结反应,五支试管：加样后，封闭管口，37水浴保温1h,鲎试剂,鲎试剂,鲎试剂,鲎试剂,鲎试剂,+,+,+,+,+,供试品,供试品,内毒素标准液,加供试品的内毒素液,检查用水,A,B,C,E,D,结果判定：缓缓倒转180度凝胶不变形，不滑脱为阳性,(7)异常毒性试验进行小鼠和豚鼠两种动物实验,(8)热原质试验进行家兔动物实验,(9)生物学效价试验进行动物体内实验或细胞培养计数法,
