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1、第三章 基因工程载体,第一节 基因克隆技术概述,一、基因克隆技术 基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组的DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。二、目的基因的取得 1、直接 2、反转录酶 3、化学合成 4、基因文库 5、PCR,首先利物理方法（如剪切力、超声波等）或酶化学方法（如限制性内切核酸酶）将生物细胞染色体DNA切割成为基因水平的许多片段，继而将这些片段与适当的载体结合。将重组DNA转入受体菌扩增，获得无性繁殖的基因文库，再结合筛选方法，从众多的转化子菌株中选出含有某一基因的菌株，从中将重组的DN
2、A分离、回收。这种方法也就是应用基因工程技术术分离目的基因，其特点是绕过直接分离基因的难关，在基因组DNA文库中筛选出目的基因。可以说这是利用“溜散弹射击”原理去“命中”某个基因。由于目的基因在整个基因组太小，在像当程度上还得靠“碰运气”，所以人们称这个方法为“鸟枪法”或“散弹枪”实验法。,面包酵母吲哚甘油磷酸脱氢酶基因的制取，先用EcoRI把面包酵母DNA切成许多片段，使这些片段与载体连成重组DNA，可把这些重组DNA导入“吲哚甘油磷酸脱氢酶型组氨酸缺陷型”大肠杆菌，在基本培养基中培养。只有引入了该基因的细菌才能生长。进一步分离这种菌株，可以得到目的基因。,三、重组体的构建,1、载体 要把一
3、个有用的基因通过基因工程手段送进生物细胞中，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫载体（Vector）。（1）质粒（plasmid)（2）噬菌体的衍生物（3）科斯质粒（cosmid）（4）单链DNA噬菌体M13（5）病毒,2、载体的性质1）它必须具有能够在某些宿主细胞中独立地自我复制和表达的能力。2）载体DNA的分子量应该较小。3）载体上最好应具有两个以上的容易检测的遗传标记（如抗药性基因等），以赋予宿主细胞以不同的表型。4）载体应该具有多个限制性内切酶的单一切点；载体上的单一酶切位点最好是位于检测表型的遗传标记基因之内，这样目的基因是否已连接载体就可以通过这一表型的改变与否而得知
4、，利于筛选重组体。3、酶系的选用,四、转化及重组子筛选鉴定,1、转化（transformation)获得重组DNA以后，必须将它导入宿主细胞中以扩增表达，这个导入宿主细胞的过程称为转化（transformation）感受态（competence)、电击2、重组子3、重组子的筛选方法（1）载体上的报告基因（reporter gene)抗药性基因、lacZ基因的显色反应、发光基因（lux)（2）单菌落扩增（3）菌落杂交,第二节 质 粒 载 体（Plasmid Vector),一、质粒的概念 附加体（整合质粒，intergrative plasmid)二、质粒的一般生物学特性1、质粒DNA（1）SC
5、构型：共价闭合环形DNA(closed circle DNA,ccDNA)（2）OC构型 开环DNA(open circle DNA,ocDNA)（3）L型 线性DNA(linker DNA,lDNA),质粒名称 质粒来源 核苷酸长度（kb）分子量(MD)pTiAch5 土壤农杆菌 213 142 To L 假单胞菌 117 78 F 大肠杆菌 95 63 RP4 假单胞菌 54 36 Col E1 大肠杆菌 6.36 4.2 pBR322 大肠杆菌 4.362 2.9 pBR345 大肠杆菌 0.7 0.46,2、质粒的复制与遗传,根据质粒与宿主菌的相关程度 某种质粒在一个细菌细胞内的数目就
6、称为这种质粒的拷贝数（copy number）严密型质粒（stringent plasmid)松弛型质粒(relaxed plasmid)根据质粒是否带有转移基因（tra基因）接合型质粒（传递性质粒）非接合型质粒,严密型质粒（stringent plasmid)严密型质粒通常是一些具有自身传递能力的大质粒，复制与宿主菌密切相关，宿主菌内只有1-2个质粒拷贝存在，当宿主菌蛋白合成停止时，质粒的DNA复制也就随之停止 松弛型质粒(relaxed plasmid)松弛型质粒通常是分子量较小，不具传递能力的质粒，它在宿主菌内通常可含10-200个拷贝，而且不受宿主菌蛋白合成的影响，当宿主菌蛋白质合成停
7、止时，例如当宿主菌遇上有抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素或壮观霉素存在时，质粒DNA的复制仍可继续进行，甚至可将数十个增至几千个。,接合型质粒又叫传递性质粒，接合型质粒可以从一个细胞自主地转移到原来不存在这种质粒的另一个细胞中去。接合型质粒的分子比较大，编码一套控制质粒DNA转移的基因。这一过程是由接合型质粒上的转移基因（tra genes）控制的。非接合型质粒，由于分子小，不足以编码全部转移体系所需要的基因，因而不能够自我转移。,所谓质粒的不亲和性，有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象 只有在确实证明
8、第二种质粒B已经进入含有第一种质粒A的寄主细胞，而它的DNA并不受寄主细胞限制体系的降解作用，但这两种质粒却不能长期稳定共存，在这种情况下，我们才能够说A和B是不亲和的质粒 质粒不亲和的分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。,根据质粒上带有特殊用途的基因,1）生殖性质粒（fertility plasmid）这类质粒简称“F质粒”，它有 tra基因，主要用于细胞间的接合生殖（F因子）2）抗性质粒（resistance plasmid）抗性质粒简称R质粒，它携带有赋予宿主细胞一种或多种抗生素抗性的基因，这些抗生素包括土霉素，氨苄霉素等。（R因子）3）Col质粒Col质粒可以编码一
9、种可杀死其他细菌的蛋白colicin。,4）降解质粒（degradative plasmid）降解质粒主要是使宿主细菌消化 一些非“正常”的分子，如水杨酸等。5）致病质粒（virulence plasmid）致病质粒赋予宿主细菌细胞以病原菌侵染性，例如土壤农杆菌中的Ti质粒（诱导肿瘤质粒，Tumor inducing plasmid）可以在大多数双子叶植物和少数单子叶植物上诱导形成冠瘿病。,3、构建质粒克隆载体的基本策略 1）分子量尽可能小，多拷贝，而且便于提取和纯化。分子量越小越能抵抗机械剪切力的切割，可容纳外源性DNA就越长。分子量小的质粒往往属于松弛型质粒。2）缺失tra基因，质粒就不会
10、从一个细菌接触转移到另一个细菌，所以是非接合型质粒。3）质粒序列中具有一个或多个单一的限制性内切酶位点。4）具有一个或几个报告基因，而且引入的基因应在限制性内切酶的单切点之内，由于插入外源基因，这个报告基因灭活，从而便于筛选重组体。,4、质粒的改造“天然质粒”:它一般是指那些没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天然质粒有ColEI、RSF2124和pSC101。第一个用于基因克隆的是天然质粒pSC101，它对于EcoRI限制酶只有一个识别位点，而且在此克隆外源DNA既不会影响它的复制功能，也不会破坏其唯一的四环素抗性 选择记号（Tetr）。,三、常
11、用的质粒载体,（一）pBR322质粒载体万能质粒之称 1、标准的质粒载体命名法则“P”表示它是一种质粒“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者FBolivar和RLRodriguez姓氏的头一个字母“322”系指实验编号“BR”恰好与“细菌抗药性”（bacterial resistance）两个词的第一个英语字母等同,2、pBR322质粒载体的物理图谱,3、pBR322质粒载体的构建,pBR322质粒的亲本之一是pMB1质粒。复制子的来源。pBR322质粒上的氨苄青霉素抗性基因（ampr）是取自于pSF2124质粒来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（tetr）;在pBR322质粒载体的构
12、建过程中的一个重要目标是缩小基因组的体积，这就需要从质粒DNA上移去一些对基因克隆载体无关紧要的DNA片段，同时也伴随着消除掉若干个对DNA克隆无用的限制酶识别位点。还要设法使质粒内存在的任何易位子统统失去功能。,4、pBR322质粒载体的优点,具有较小的分子量。统一规定pBR322质粒DNA分子核苷酸的计数从EcoR限制酶的识别位点开始，并公认该序列-GAATTC-中的第一个T为核苷酸 1。克隆载体的分子大小最好不要超过10kb（6kb）。具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。因DNA插入而导致基因失活的现象，称之为插入失活效应。AmpsTets，AmprTets，AmpsTetr
13、具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后，每个细胞中可累积10003000个拷贝。,（二）pUC质粒载体,1、概述在pBR322质粒载体的基础上，组入了一个在其5-端带有一段多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）的lacZ基因而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。pUC，是因为它是由美国加利福尼亚大学（University of California）的科学家JMessing和JVieria于1987年首先构建的。,2、pUC质粒载体的结构,（i）来自 pBR322质粒的复制起点（ori）；(ii)氨苄青霉素抗性基因（ampr），但它的DNA核苷酸序列已经发
14、生了变化，不再含有原来的核酸内切限制酶的单识别位点；（iii）大肠杆菌-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其编码-肽链的 DNA序列，此结构特称为 lacZ基因；（iv）位于 lacZ基因中的靠近 5-端的一段多克隆位点（MCS）区段，但它并不破坏该基因的功能。,3、pUC质粒载体的优点,1、具有更小的分子量和更高的拷贝数 在pBR322基础上构建pUC质粒载体时，仅保留下其中的氨苄青霉素抗性基因及复制起点，使其分子大小相应地缩小了许多 2、适用于组织化学方法检测重组体 pUC8质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ基因，所编码的-肽链可参与-互补作用。因此，在应用pUC8质粒为载体
15、的重组实验中，可用Xgal显色的组织化学方法一步实现对重组体转化子克隆的鉴定 3、具有多克隆位点 MCS区段,（三）TA克隆载体,Taq DNA聚合酶具有一种非模板依赖性活性，这种活性可以在PCR产物的3端加上一个非配对的脱氧腺嘌呤核苷（A）。根据这一特点研制出了一种线性质粒，其5端各带一个不配对的脱氧胸腺嘧啶核苷（T），采用该质粒可将PCR产物以TA连接的方式直接进行克隆，即TA克隆。用于TA克隆的载体称为TA克隆载体。,四、酵母中的质粒载体,质粒-2m环（2m长的DNA自主复制环）6kb，一个酵母细胞中含70200拷贝P1、P2编码复制所需蛋白的基因 LEU2基因编码-异丙基苹果酸脱氢酶
16、该酶参与将丙酮酸变成亮氨酸的生化过程 使用LEU2基因作选择标记时，宿主酵母菌必须是没有LEU2基因的营养缺陷型突变株（LEU2-）,质粒-2m环,宿主酵母菌（LEU2-）LEU2基因 丙酮酸 亮氨酸不含附加亮氨酸的培养基 不含附加亮氨酸的培养基 不能生长 生长,酵母游离质粒（yeast episomal plasmids,YEps）酵母整合质粒（yeast integrative plasmids.YIps）酵母复制质粒（YRps）穿梭质粒（shuttle plasmid）,pJDB 219,选用哪种类型的真菌质粒？,转化频率 YEps：103105 YIps：1-10转化子的稳定性YEps
17、：不稳定 YIps：稳定,第三节 其 它 载 体,一、噬菌体载体,1、噬菌体的基本特征 Bacteriophage(phage)；phagos（1）生物学特性 对寄主功能的依赖性 保持自己的生命、利用寄主细胞的核糖体、合成蛋白质的因子，各种氨基酸及产能体系保护自己的核酸分子免遭环境化学物质的的破坏将核酸分子注入到被感染的细菌细胞产生大量的子代噬菌体颗粒使感染的细菌细胞释放出子代噬菌体颗粒,2、噬菌体的结构及其核酸类型,结构类型无尾部的二十面体型有尾部的二十面体型线状体型核酸类型双链线性DNA、双链环形DNA、单链环形DNA、单链线性DNA、单链RNA,T2噬菌体颗粒示意图,3、噬菌体的感染性（
18、1）噬菌体的溶菌生命周期,（2）噬菌体的溶源周期,（）有关的概念：温和噬菌体（temperate phage）溶源性细菌（lysogen)溶源化（lysogenization)整合（intergration）原噬菌体（prophage）,（）溶源周期的主要特征,部分噬菌体的性质 名称 核酸 分子质量 构型 宿主 T4 dsDNA 130106 线形 E.coli，烈性 dsDNA 32106 线形 E.coli，温和 P1 dsDNA 58106 线形 E.coli，温和 P22 dsDNA 27106 线形 志贺氏菌，沙门氏菌，温和 M-1 dsDNA 28106 线形 E.coli 174
19、 ssDNA 1.7106 环状 E.coli，烈性 M13 ssDNA 2.1106 环状 E.coli R17 ssDNA 1.1106 线形 E.coli（F+）烈性,二、噬菌体克隆载体,1、与构建克隆载体相关的噬菌体性质 DNA 噬菌体的DNA在噬菌体中是线状DNA分子，全长48 502 bp，左右两端各有12个核苷酸组成的 5凸出黏性末端（cohesive end），而且两者的核苷酸序列互补，即 5GGGCGGCGACCTNNNN3 3NN NNCCCGCCGCTGGA5 DNA进入宿主细胞后，黏性末端连接后形成环状DNA分子。把此能连接的末端称为 cos位点（cohesive en
20、d site）,噬菌体基因组,除了两个正调节基因N和Q之外，其余的是按功能的相近性聚集成簇的。例如，头部、尾部、复制及重组四大功能的基因（i）左侧区，自基因 A到基因J，包括参与噬菌体头部蛋白质和尾部蛋白质合成所需要的全部基因。（ii）中间区，介于基因J与基因N之间，这个区又称为非必要区。本区编码的基因与保持噬菌斑形成能力无关，但包括了一些与重组有关的基因（例如 redA和redB），以及使噬菌体整合到大肠杆菌染色体中去的int基因，和把原噬菌体从寄主染色体上删除下来的xis基因。,（iii）右侧区，位于N基因的右侧，包括全部主要的调控成份，噬菌体的复制基因（O和P）以及溶菌基因（S和R）。,
21、限制性核酸内切酶识别位点。DNA上有56种限制性核酸内切酶的识别位点噬菌体的生长途径 噬菌体感染大肠杆菌后，线形DNA注入细胞内，或者进行溶菌生长途径，黏性末端连接，成为环形DNA分子，指令宿主细胞合成与包装相关的系列壳蛋白和酶，复制新的DNA，包装成子代噬菌体颗粒，并且在DNA指令宿主细胞合成的R蛋白和S蛋白作用下，宿主细胞破裂，释放出大量子代噬菌体颗粒，感染新的细胞；,或者进行溶源生长途径，在其宿主细胞合成的int基因产物作用下，DNA整合在染色体DNA上，随染色体DNA的复制而复制，以原噬菌体的形式潜伏起来，一旦宿主细胞处于某种胁迫条件下时，在DNA指令宿主细胞合成的xis 基因产物作用
22、下，DNA脱离染色体，重新进入溶菌生长途径。,2、噬菌体作为构建克隆载体材料的依据,噬菌体是一种温和噬菌体能承载比较大的外源DNA片段。在DNA分子上有多种限制性核酸内切酶识别位点，便于多种外源DNA酶切片段的克隆,3、构建噬菌体克隆载体的基本策略,构建噬菌体克隆载体的基本策略是在DNA上切去部分非必需的区域，抹去多余的限制性核酸内切酶切割位点，插入可供选择的标记基因，建立体外包装系统,4、噬菌体克隆载体的主要类型,1）插入型载体免疫功能失活的插入型载体：外源DNA插入，不能进入溶源周期，清晰的噬菌斑。半乳糖苷酶失活的插入型载体2）替换型载体（取代型载体）在载体中央部分有一个可以被外源插入的D
23、NA所取代的DNA分子片段,5、重组体DNA的体外包装,1）相关概念 转染（Transfection）转导（Transduction）转染效率：105-106，107,2）DNA的体外包装（1）概念（2）原理（3）DNA的包装限制 75%-105%，48kb，51kb，28kb，23kb,6、重组体分子的选择方法,1）cI基因功能选择方法 cI基因编码的阻遏蛋白质，促使感染了噬菌体的大肠杆菌寄主细胞发生溶源化反应。溶菌化反应：清晰型噬菌斑（重组体分子：cI-）溶源化反应：混浊型噬菌斑（非重组体分子：cI+）2）lac Z基因功能选择法 重组体分子：白色的噬菌斑 非重组体分子:蓝色的噬菌斑,3）
24、Spi-选择法（Sensitive to P2 inhibition）red gam基因的编码产物，会抑制噬菌体使之无法在P2噬菌体溶源性的细菌中正常生长，而red-gam-噬菌体能正常生长。重组体分子：在P2噬菌体溶源性的细菌中正常生长,7、噬菌体克隆载体的应用,噬菌体克隆载体主要用于建立cDNA基因文库。某种生物的一系列cDNA分子先通过置换或插入的方法与合适的噬菌体克隆载体重组，然后或者经体外包装成噬菌体颗粒后转导受体菌细胞，或者不经体外包装直接转染受体菌细胞。,三、柯斯（cosmid）克隆载体,“cosmid”一词是由英文“cos sitecarrying plasmid”缩写而成的，
25、其原意是指带有粘性末端位点（cos）的质粒。所谓柯斯质粒，乃是一类由人工构建的含有DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。,DNA片段除了cos位点之外，在其两侧还具有与噬菌体包装有关的DNA短序列；而质粒DNA部分则是一个完整的复制子，编码着一个复制起点和两个抗菌素抗性基因ampr和tetr。柯斯质粒兼具了噬菌体载体和pBR322质粒载体两方面的优点。其克隆能力为3145kb。,cosmid克隆载体的特征构建的cosmid克隆载体是一种环形双链DNA分子，其大小不超过36.4 kb，一般在10 kb以下。这种克隆载体具有质粒的性质，可以在大肠杆菌细胞内按质粒复制的方式进行复制，具
26、有转化大肠杆菌的功能。在此克隆载体上含有一个cos位点。在A蛋白作用下cos位点被切开，提供体外包装必需的cos末端,构建的cosmid克隆载体较小，因此能承载比较大的外源DNA片段。cosmid克隆载体能克隆40 kb左右的外源DNA片段。所以被广泛地用于构建基因组文库。,四、人工染色体克隆载体,人工染色体克隆载体实际上是一种“穿梭”克隆载体，含有质粒克隆载体所必备的第一受体（大肠杆菌）源质粒复制起始位点（ori），还含有第二受体（如酵母菌）染色体DNA着丝点、端粒和复制起始位点的序列，以及合适的选择标记基因。人工染色体克隆载体的特点是能容纳长达1000 kb甚至3000 kb的外源DNA片
27、段,YAC载体（yeast artificial chromosome）,YAC（酵母人工染色体）克隆载体是最早构建成功的人工染色体克隆载体，将酵母染色体DNA的端粒（TEL）、DNA复制起点（ARS）和着丝粒（CEN）以及必要的选择标记（HISA4和TRP1）基因序列克隆到大肠杆菌质粒pBR322中，构建成YAC克隆载体。人类人工染色体（HAC）克隆载体哺乳动物人工染色体（MAC）克隆载体,细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC）可转基因人工染色体（transformationcompetent articial chromosome,TAC）,
