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1、GENE MANIPUTATION AND ITS APPLICATION IN MEDICAL PRACTICE,基因操作及其医学应用,鲍 朗 教 授,基因操作的基本策略,基因操作的基本策略 1.概述 2 DNA和基因的近代概念 3.基因操作的基本内容和程序,内 容 提 纲,理论三大发现 生物遗传物质是DNA(Avery，1934)DNA双螺旋模型(Watson,C.S.H.Crick C.B.1953)遗传中心法则(Nirenberg，1961-1966),概 述,基因操作的基本策略,技术上的三大发明 限制性内切酶(Smith etal.1970)载体(Cohen 1973)逆转录机制(B
2、altimore 1970),基因操作的概念,基因操作的基本策略,定义：在基因水平上进行人工操作并改变其生物遗传性的技术称基因操作。所采用的主要手段为DNA重组技术，主要程序是将DNA片段插入到质粒、病毒等载体中，形成遗传 物质的新组合，然后 转移到宿主细胞中扩 增和表达。,DNA的生化特性,DNA的结构,DNA的生化特性,DNA的结构,DNA 的生化特性,DNA的半保留复制,RNA 的生化特性,mRNA mRNA占细胞RNA总量的1%5%，分子量范围几百2万个核苷酸，变化大（RT/PCR）。原核和真核生物mRNA的结构不同。tRNA 各种物种的tRNA均含有7393个核苷酸，一端是CCA结合
3、氨基酸部位，另一端为反密码子环。tRNA通晓mRNA的核苷酸语言和蛋白质的氨基酸语言（AARS），是蛋白质翻译的译员。,RNA 的生化特型,rRNA rRNA与核糖体蛋白共同构成核糖体，后者是蛋白质合成的场所。,核糖体的组成,What is the Gene?,基因（gene）是核酸贮存遗传信息的遗传单位，是贮存有功能的蛋白质多肽链或RNA序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。该顺序可以产生或影响某种表型，可以由于突变生成等位基因变异体。,基因组的基本结构,基因组（genome）指细胞或生物中，一套完整单倍体遗传物质的总和，包括全套基因及间隔序列。人类基因组包含22条常染色体和XY两条
4、性染色体上的全部遗传物质（核基因组）以及线粒体上的遗传物质（线粒体基因组）。,原核基因组和真核基因组,真核生物基因组远远大于原核生物的基因组，结构复杂，基因数庞大，具有许多复制起始点，每个复制子大小不一人类染色体单倍体DNA全长3109bp，含34万个基因。大肠杆菌DNA全长4.6106bp，含4000个基因。,原核基因组 Prokaryote Genome,基因组通常仅由一条环状双链DNA分子组成。基因组中只有1个复制起点。基因组中的重复序列很少，编码蛋白质结构基因多为单拷贝。基本结构特点：启动子（promoter）、操纵基因（operator）、调控序列、结构基因（structure ge
5、ne）、终止子（terminator）。基因序列是连续的，无内含子结构连续密码区 mRNA Protein,基本结构：结构基因（structural gene）指能转录成为mRNA、rRNA或tRNA的DNA顺序。结构基因不连续，编码序列被非编码序列打断，分割成几段，编码序列称为外显子(extron)，其间的序列称为内含子(intron),称为断裂基因（split gene）。,非编码区 剪切 编码区 编码区 mRNA Protein,真核基因组 Eukaryote Genome,intron,exon,exon,有大量重复序列,原核生物基因表达的调控,原核生物基因表达的调控方式最重要的特点是
6、操纵子模式。主要通过及时调整酶系统基因表达以适应环境，获取营养。调控水平主调在转录水平，翻译水平次之。,真核生物基因表达的调控,真核生物基因调控远比原核生物复杂，绝大多数真核生物基因极少数与环境变化有直接或间接的关系，其调控最大特点是遗传程序调控。调控主要水平是转录水平。其次为转录后水平、DNA水平、翻译及翻译后水平等。,1目的基因的获取 2DNA体外重组3重组DNA的转化与增殖4阳性重组体的筛选 探针、PCR、测序5目的基因的表达 表达产物的应用,限制性内切酶,载体,分子杂交,基因操作的基本内容和程序,基因操作的基本策略,1.目的基因的获取 1)基因库筛选、扩增:Shot gun 限制性酶法
7、，机械切割。2)逆转录法 逆转录酶合成全长或近全长ds-cDNA 3)人工合成基因：小片段连接，Polymerase Chain Reaction,基因操作的基本内容和程序,基因操作的基本策略,2.DNA体外重组常用的工具酶（tool enzymes）限制性核酸内切酶（resriction enzymes,restriction endonadease)DNA连接酶（DNA ligase,ligase)逆转录酶(reverse transcriptase)DNA聚合酶(DNA polymerase,DNA pol)核酸酶(nuclease)末端转移酶(terminal transferase)
8、碱性磷酸酶(BAP或CIP),粘端切割酶：错位切割双链DNA，产生5或3粘性末端；,5-GAATTC-33-CTTAAG-5,5-G AATTC-33-CTTAA G-5,EcoR,5粘性末端,5-CTGCAG-33-GACGTC-5,5-CTGCA G-33-G ACGTC-5,Pst,3粘性末端,1）.限制性核酸内切酶（resriction enzymes,restriction endonadease),平头切割酶：沿对称轴切割DNA双链，产生平端。,5-CCCGGG-33-GGGCCC-5,5-CCC GGG-33-GGG CCC-5,平端,Sma,同功异源酶：来源不同但能识别和切割同
9、一位点的限制酶。,5-GGATCC-33-CCTAGG-5,Bam H和Pst 的共同识别位点,限制性核酸内切酶（resriction enzymes,restriction endonadease),是独立于许多细菌及某些真核细胞染色体外共价闭合环状的双链DNA分子，大小在1200kb之间，能独立复制的最小遗传单位。,2）.质粒（plasmid）,质粒的分类,克隆载体(cloning vector)都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。表达载体(Expression vector)具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mc
10、s等），还具有转录/翻译所必需的DNA顺序。为了有效的转录，必需有强大的能够被宿主细胞识别的启动子。,人工构建质粒载体必备条件：较小分子量和松弛复制子，都能独立自主的复制；基因组上有一到两个筛选标记，都能便利的加以检 测（抗生素抗性）；有一到数个限制性内切酶位点，容易引进宿主细胞中去，也易从宿主细胞中分离纯化（提质粒）。理想条件：插入失活筛选标记,3）.目的基因片段与载体的连接,粘末端法：碱性磷酸酶退火 平接法：T4噬菌体DNA连接 接头法：人工合成R.E识别顺序 聚尾法：分别加连polyA(T)或G,3重组DNA的转化与增殖 制备 Competence Cell（氯化钙处理幼嫩E.coli,
11、yeast,动物cell,昆虫.)CCell-R.DNA”Hot shock”(42，2)LBCulture-37，lhr-LBagarplate-genomic library,阳性重组体的筛选 抗药基因抗Ampicilin基因 Ampicilin敏感受体细胞 Ampicilin 培养基未转化菌落不能存活,颜色反应Lac+Polylinker+-半乳糖苷酶 Xgal蓝色/白色,利用,影印原位杂交（Situ Hybridization)菌落 硝酸纤维滤膜阳性重组体,原位固定,重组探针杂交,斑点杂交(Dot Blots)已知重组DNA滤膜重组DNA同源性和特异性,方阵打点,阳性重组DNA探针杂交
12、,基因操作的基本策略,southern杂交DNA片段吸印重组探针杂交后处理,5外源基因表达克隆基因在原核细胞中表达克隆基因在哺乳动物细胞中表达克隆基因在其它表达系统中表达 昆虫表达系统 酵母表达系统,在原核表达体系（以Ecoli为代表）：优点1.遗传背景清楚,易于调控;2.表达技术经典成熟,应用广泛,目前无以取代;3.目的基因表达水平高,E.coli培养周期短，“物美价廉”.缺点1.缺少真核蛋白质翻译后加工修饰系统,如剪切,糖基化,及正确二硫键形成等;2.表达蛋白质多以包涵体形式存在,需经复性才能 恢复构象与活性.3.宿主本身杂蛋白质多,纯化步骤复杂,故某些蛋白质,特别时糖蛋白或脂蛋白,酌情选择真核表达载体。,真核表达体系（酵母、昆虫、哺乳动物细胞）优点：能转录后加工，即能剪接内含子；能翻译后加工，即能糖基化修饰等；通常不形成包涵体，能正确折叠。缺点：但技术难度较大，成本较高，表达量较低。,目的基因高效表达,三个因素：强化蛋白质的生物合成 抑制蛋白质的降解 恢复蛋白质的空间构象,
