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1、,GENE MANIPUTATION AND ITS APPLICATION IN MEDICAL PRACTICE,基因操作及其医学应用,鲍 朗 教 授,转基因和基因治疗,转基因和基因治疗 1概念和研究现状 2基因治疗的基本类型 3转基因的基本方法 4.转基因的表达和调控 5基因治疗的运用和前景,内 容 提 纲,基因治疗是以正常基因替代或置换靶细胞染色质基因组中的致病基因从而产生新表型的治疗方法。转基因技术则是将目的基因导入靶细胞以建立治疗效应的方法和过程。,转基因及基因治疗,基 本 概 念,转基因及基因治疗,基因治疗的程序,目的基因,转基因,基因表达,基因治疗,viral,nonviral
2、,In vivo,ex vivo,体内调控,基因治疗的基本类型,细胞介导的基因治疗(ex Vivo),是当前较常用的形式。是选用适当的靶细胞载体外进行基因转移，筛选阳性细胞重新移植入体内。可用原代或细胞系进行。但靶细胞存活较短暂（Transit)。,体外表达基因治疗(in Vitro)是传统的基因表达形式。,转基因的基本方法,非病毒法(Nonviral),病毒法(Viral)和,1、病毒法(Viral)1)逆转录病毒(Restrovirus)RNA病毒，结构缺陷 Packaging Cell,转基因及基因治疗,转基因的基本方法,体内直接转基因治疗（in Vivo）,转基因及基因治疗,基因治疗的
3、基本类型,是最有前途的方式。已在肝、气管、肌肉、乳腺、腹腔动、静脉初获成功。效果持久。但转移和表达效率低。,优势：整合率高;对外源DNA影响小;单拷贝整合，利于表达调控；安全。,转基因及基因治疗,转基因的基本方法,劣势：容量小;只能感染分裂活跃细胞，体外(Exvivo)转基因;Transite expression;R.V.+P.C+P.C 实验室要求高。,转基因及基因治疗,转基因的基本方法,2）腺病毒(Adenovirus)腺相关病毒(Adenoassociated virus)DNA病毒 E1和E3基因缺乏 263细胞系生长,转基因及基因治疗,转基因的基本方法,特点：能感染静止细胞，体内(
4、in vivo)转基因 对某些细胞类型特别亲和力，利于局部基因治疗 包容量大 尚无Packaging Cell，欠安全 有较强免疫原性，易引起体内免疫反应,转基因及基因治疗,转基因的基本方法,2、非病毒法(Nonviral)1）显微注射法(Microinjection)2)基因定位整合技术(Gene targeting)3)受体介导(Receptor-mediated methods)4)组织内直接注射(Direct injection of DNA)5)磷酸钙沉淀法(CaPO4 precipitation),转基因及基因治疗,转基因的基本方法,基因定位整合技术（基因打靶 Gene Targe
5、ting),基因打靶的概念通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。这一技术称为基因打靶。若定向敲除某个基因，称为基因敲除（gene knockout）；若定向将一段基因序列替代另一段基因序列，则称为基因敲入（gene knockin）。,基因打靶的必要条件打靶载体 打靶载体中的必要成分：载体DNA 目的基因同源片段 筛选标志基因 neu（新霉素）阳性筛选标志基因；HSV-tk阴性筛选标志基因。胚胎干细胞,基因敲除的基本程序 1、构建打靶载体 A.获得目的基因的同源片段，将此片段克隆到一般的质粒载体中；B.从重组质粒中切除目的基因的大部分同源DNA序
6、列，只留部分序列在线性质粒载体的两端；,C.将neu基因克隆到带有目的基因同源序列的线性质粒中，使之位于残留目的基因同源序列的中间；D.在目的基因同源序列的外侧线性化重组质粒载体，将HSV-tk基因克隆到此线性载体中。,2、打靶载体导入ES细胞3、基因敲除ES细胞注射入胚泡4、胚泡植入假孕的小鼠子宫中5、嵌合体的杂交育种,附 表 外源DNA的整合,转基因及基因治疗,转基因的基本方法,Table 1.Methods of delivering genes into mammalian cells and likely applications in gene therapy(+).Major a
7、pplication:(+/-),some application;(-).Little or no application;T.only transient expression;S.stable expression,Science,Vol.260:14 May,1993,1.启动子(promoter)选用或设计适当地强启动子能使外源性基因在宿主体内高效表达。2内含子(intron)在转基因过程中，内含子可增强基因表达。,转基因及基因治疗,转基因的表达和调控,3反式作用因子(Trans-activator)能激活不同种外源基因转录，提高转录基因的表达效率。4载体(Vector)要考虑病毒载
8、体与外源基因之间的相互干扰，必要时切除载体上无关序列，以决定病毒载体与目的基因的最佳组合，使其表达达到最佳效率。,转基因及基因治疗,转基因的表达和调控,1、肿瘤的基因治疗 1)肿瘤的免疫基因治疗 载体细胞靶向表达细胞因子 载体细胞:肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)淋巴因子激活的杀伤细胞(LAKs)细胞因子:IL-1,2,4,6,7,IFNs，TNF-,CSF。肿瘤疫苗:改变肿瘤细胞免疫原性，诱导强 烈免疫反应,转基因及基因治疗,基因治疗的应用,2)反义技术抑制肿瘤基因功能 人工合成癌基因DNA或RNA(mRNA)互补寡核苷酸，“封闭”癌基因的转录或翻译。,转基因及基因治疗,基因治疗的应用,3)病毒
9、导向酶解药物前体疗法(VDEPT)-“自杀基因”(Suicide gene)该基因编码的酶能活化无毒药物前体杀伤该酶所在的细胞。将“自杀基因”转染肿瘤细胞，使用对正常细胞无毒药物前体，选择杀伤肿瘤细胞。,转基因及基因治疗,基因治疗的应用,转基因及基因治疗,基因治疗的应用,(肝癌细胞）单纯疱疹胸苷激酶(HSV-Tk),甲氧嘌呤阿拉伯糖苷,AM(D.T)阿拉伯糖苷酸,杀伤肝癌细胞（无毒前体）,活化,2传染病基因治疗 1）刺激更强的机体抗HIV免疫反应,转基因及基因治疗,基因治疗的应用,(HIV患者)成纤维细胞,HIV pM160,g p 160,诱导细胞毒T淋巴细胞杀伤HIV感染细胞,R.V.,表
10、达,2）干扰病毒复制,转基因及基因治疗,基因治疗的应用,核酸(Ribozyme):Ribozyme geneHIV患者CD4 破环基因完整性,反义药物 GEM-91:25bps反义寡核苷酸 HIV gag蛋白 mRNA 抑制HIV复制,封闭,转基因及基因治疗,3）其它传染病基因治疗：HBV 流感病毒 单纯疱疹病毒 流行性出血热 水泡性口炎病毒,基因治疗的应用,3遗传病的基因治疗 腺苷酸脱氨酶缺乏症(ADA)(欧盟、美国)囊纤维变性(CF)(美国、英国)人家族性高胆固醇血症(FH)(美国)血友病B-IX因子成纤维细胞表达(中国)地中海贫血(中国),转基因及基因治疗,基因治疗的应用,转基因及基因治疗,基因治疗的应用,4神经系统疾病的基因治疗,*这些遗传病能造成神经系统损伤,转基因及基因治疗,基因治疗的应用,5心血管系统疾病的基因治疗,6其它：色素性视网膜炎、红斑狼疮，血液疾病，慢性肝病等。,转基因及基因治疗,基因治疗的应用,转基因及基因治疗,基因治疗的应用,基因治疗的体内调控无需精确调控的病种：遗传性疾病、肿瘤、感染性疾病等需精确调控的病种：2型糖尿病等,
