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1、以微生物细胞表面展示为主线的基因操作原理,2004年4月22日星期四,通常是指通过遗传操作将外源大分子定位表达在微生物细胞表面以便直接利用全细胞进行后续工作而无须基因产物的 提取、纯化、和重新折叠等操作,一、微生物细胞表面展示 Microbial cell surface display,MCSD,微生物细胞表面展示,第一部分,MCSD主要以构建融合蛋白方式来实现,即将外源蛋白与菌体的某一表面蛋白相融合,借助后者的表面识别和表面定位功能,将前者携带并定位在细胞表面,前者称为乘客蛋白，后者称为运载蛋白,即将外源蛋白与菌体的某一表面蛋白相融合,借助后者的表面识别和表面定位功能,将前者携带并定位在细
2、胞表面,前者称为乘客蛋白，后者称为运载蛋白,宿主菌细菌和酵母菌,展示了病原菌的抗原表位、多聚组氨酸肽、蛋白质文库、金属硫蛋白、多种酶类、多种单链抗体和T细胞受体的信号分子,运载蛋白膜蛋白、附属结构蛋白、粘附蛋白、凝集素、以及S-层蛋白等,宿主菌细菌和酵母菌,展示了病原菌的抗原表位、多聚组氨酸肽、蛋白质文库、金属硫蛋白、多种酶类、多种单链抗体和T细胞受体的信号分子,运载蛋白膜蛋白、附属结构蛋白、粘附蛋白、凝集素、以及S-层蛋白等,二、微生物细胞表面展示技术的应用MCSD技术广泛应用于生物工程领域，可开发和利用来进行蛋白构象的分析、活菌疫苗的研制、临床诊断、表面抗原的直接克隆、以及抗体工程应用等。
3、,1.构建和筛选蛋白质文库 2.开发活菌体疫苗，制备抗血清和多克隆抗体 3.构建全细胞催化剂4开发新型微生物吸附剂5研制新型生物传感器,三、举例,Display of Poly-His Peptides on Escherichia coli Cell Surface,在大肠杆菌细胞表面展示多聚组氨酸肽,Schematic Presentation of E.coli OmpC,LQ 位点含PstI位点,GATAGATACCTGCAGGTCGACCCAAGCGGACATCACCATCATCACCATTCTGGTCTCGAGGATATCCTGCAGTTGGCTATCTATGGACGTCCAGCT
4、GGGTTCGCCTGTAGTGGTAGTAGTGGTAAGACCAGAGCTCCTATAGGACGTCAACC,Poly(His)6,XhoI,PstI,PstI,SalI,L Q V D P S G,S G L E D I L Q,GATAGATACCTGCAGGTCGACCCAAGCGGACATCACCATCATCACCATTCTGGTCTCGAGGATATCCTGCAGTTGGCTATCTATGGACGTCCAGCTGGGTTCGCCTGTAGTGGTAGTAGTGGTAAGACCAGAGCTCCTATAGGACGTCAACC,GTCGACCAGCTG,CTCGAGGAGCTC,GTC
5、GAGCAGCTC,CTCGACGAGCTG,SalI,XhoI,XhoI,PstI,PstI,SalI,Sequence Inserted into OmpC L7,Expression of OmpC-(6His)n at 30C,Fraction of OmpC or its derivates of the total outer membrane proteins,1,2,3,4,5,6,Expression of OmpC-(6His)n at 25C,Fraction of OmpC or its derivates of the total outer membrane pro
6、teins,1,2,Interaction Between Neighboring Histidines and Ni-NTA Agarose,Each Ni2+require six pairs of electrons to form a stable coordination sphere around;four of them are available from NTA,and two of the other two are expected from neighboring histidines.,NTA:nitrilotriacetic acid 次氮基三乙酸,Ni-NTA-A
7、garose Surface bound cells of(a)MC4100(pTCHP2)and(b)MC4100(pTCHP3),Attachment to Ni-NTA-Agarose beads,碘化丙锭 染色细胞,543nm氦/氖激光，570nm 光栅,Attachment to Ni-NTA-Agarose beads,pTCdP,pTCHP1,pTCHP2,pTCHP12,pTCHP6,pTCHP3,All recombinant cells could attach to the surface of Ni-NTA-Agarose,Poly-His peptides were
8、exposed successfully,beads,except MC4100(pTCHP18),Cd2+Adsorption of MC4100(pTCHPn),The adsorption capacity increased along with the increasing,MC4100(pTCHPn)can be used as bioadsorbents.,number of 6His units.,三、S-层蛋白用于表面展示,细菌表面S-层,细胞膜,细胞壁,S-层,Cell surface layer,S-layer,第二部分 细菌细胞表面S层简介,一、S-layer 的分布,
9、广泛存在于许多古细菌和真细菌的细胞最外表面,在绝大多数古细菌当中，S层是细胞唯一的外壁层,在所有的主干细菌类群中的几百个种中都检测到,对于发现S-层的某个种来说，并不是每一个分离株都存在S-层,尽管S-layer分布广泛，但其存在在相当长一段时间内并没有引起人们的重视,因为 S-layer 在实验室培养过程中容易丢失，Freeze-etching electron microscopy 能观察到,S-层可在细胞生长的所有阶段完全覆盖在细胞表面,二、S-层的结构和组成,由蛋白质或糖蛋白构成的单分子晶格状的聚合层,由蛋白质或糖蛋白构成40kDa-200kDa,50 nm,G-古细菌,G+细菌,G-
10、真细菌,a.嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius(古细菌);b.杀鲑气单胞菌(G-);c.苏云金芽胞杆菌(G+)。PM,质膜;PG,肽聚糖层；OM,外膜；CW,细胞壁；S,S-层。内标50nm。,完整细胞表面覆盖5105 单体,500copies 单肽/秒 合成，转运至细胞表面，组装成晶格结构,Generation time:20-30min,S-层蛋白的启动子是非常强的,Lactobacillus acidophilus(嗜酸乳酸杆菌)S-层蛋白的启动子乳酸脱氢酶基因启动子的两倍(是细菌中最强启动子之一),炭疽芽胞杆菌Sap蛋白由814aa组成含N-末端29aa信
11、号肽，其SLH位于N-末端200aa以内，通过该SLH已使聚蔗糖果聚糖酶成功地在细胞表面得到表达其表达的分子数与细胞表面S-层中S-层蛋白的分子数相当,四、S-层的应用前景,人们对S-层的应用潜力寄予厚望在生物技术和仿生学方面,1.S-层可开发成超滤膜分子筛,2.S-层在开发疫苗方面具广阔前景与特异性抗原或半抗原结合可作为佐剂系统加以使用,3.提高脂膜的稳定性通过S-层蛋白在脂膜上重结晶成S-层，可明显提高脂膜的稳定性，便于研究膜蛋白的生物学功能,4.S-层在纳米材料方面有巨大应用潜力S-层可作为形成有序排列的纳米金属或半导体材料的模板;这些具有特殊物理性质的材料可广泛用于纳米电子学和非线性光
12、学的研究,5.细胞表面展示,Cell surface display,S-层是一个极有前途的、可用于细胞表面定位表达蛋白质的展示系统,S-层蛋白表达量高，可达细胞蛋白的15%，而且可有效地与细胞壁结合,第三部分 利用S-层蛋白进行表面展示的基因操作,一、S-层蛋白的基因克隆,苏云金芽胞杆菌，具杀虫活性,苏云金芽胞杆菌,一种细菌广泛存在于土壤等自然环境,简称 苏云金杆菌 或 Bt,Bacillus thuringiensis,伴胞晶体,(kDa)20011697.466453121.5,SDS-PAGE profile of crystal protein of Bacillus thuring
13、iensis CTC and T02 strain,M CTC T02 M,苏云金芽胞杆菌 CTC,测定 CTC 蛋白(100kDa)第一次：A G K S F P D V P A D H W G I第二次：A G K S F P D V(P)A,Primer design CTC-46 GCA GGA AAA TCA TTC CCA GAC GTT C,Digested CTC DNA with various restriction enzymes,Southern hybridization to CTC DNA(DIG-labeling),Kb ladder,Restrict loca
14、tion of ctc gene,9.0kb HpaII,9.5kb EcoRI,以9.0kb HpaII和9.5kb EcoRI为目标构建文库,E.coil X-Blue(pBMB982)重组E.coil 生长艰难 易于自溶,构建亚基因组文库以基因组中某些DNA片段为目标所构建的DNA 文库,但在以9.0kb HpaII和9.5kb EcoRI为目标构建的文库中，得不到阳性克隆子,表达S-layer蛋白的E.coli,3.1kb ClaI,2.9kb XbaI,X 281,4082bp EcoRI-ClaI,pBMB982,第一个来自苏云金芽胞杆菌的S-层蛋白基因(Sara et al,J.
15、Bacteriol,2000),DNA Sequencing EcoRI/ClaI fragment The 4082 bp sequenced 816 aa encoding capability GenBank AJ012290,3141 ATTAAAGAAG TAAAAGAAGT AAAATAATAA TTATTAAAGC I K E V K E V K-3181 CTATGAGAAA ATAGACAAAA GTCTATGAGT ATCATAGGCT 3221 TTTTATTTTG ATCTTATTTC ATATATATTT TAGATTGAAG,X 281,4082bp EcoRI-C
16、laI,pBMB982,Cloning of ctc-2 gene,ClaI:3.1kb 2.9kb,ClaI 2.9kb in pKS,ClaI,ClaI,ClaI,ctc-2 gene,ctc-1 gene,Full length ctc-2 gene?,Problem 1,ClaI-ctc-2 gene(2.9kb)can not be recovered,ATCGATCGTGCTTCTGCAGCTGTAATCTTCAC,ClaI,Dam methylation site,ClaI is sensitive to methylation,GM2163:dam-dcm-VJS987:dam
17、-,Purify plasmid from dam-E.coli,ClaI,ClaI,ClaI,ctc-2 gene,ctc-1 gene,Problem 2,ctc-1 gene can not be recovered at its 3-end,实际使用pIJ2925,ATCGATTAGCTA,GTCGACCAGCTG,ClaI,AccI,ATCGACTAGCTG,ligation,ATCGACCGGCATGCAAGCTTTAGCTGGCCGTACGTTCGAA,SphI,HindIII,SphI,ATCGACCGGCATG CAAGCTTTAGCTGGCC GTACGTTCGAA,Kle
18、now/dATP,ATCGA CAAGCTTTAGCTGGCC AA,Mung Bean Nuclease,ATCGA CAAGCTTTAGCTGGCC AA,Mung Bean Nuclease,ATCGA TTTAGCT AA,ligation,ATCGATTTAGCTAA,Recovering ClaI,8611/ClaI K23/ClaI,二、表达载体,稳定,安全,高效表达,（一）质粒复制区的克隆,利用Bt 内源质粒的复制片段作为载体稳定因素,任何一个质粒都含有一段与复制有关的区域，包括1.复制起点and/or2.复制蛋白复制起始蛋白基因and/or 3.其他,任何一个质粒的复制有宿主
19、特异性如在Gram+/Gram-有差异,Gram+细菌质粒复制区克隆载体,Ori/E.coliAmp 抗性基因(E.coli or Gram)Sp 壮观霉素抗性基因(Gram),1.ori 9741 GenBank AF202532 2.ori 2062 GenBank AF050161,cry3Aa,pBMB608,pBMB685,稳定性为 99.5%无抗生素选择压力40代,stability test,以内源质粒为基础的质粒载体 在无选择压力的情况下，能够稳定遗传,（二）解离载体的构建,Res tnpI tnpA,Tn4430,转座子,通过体内重组可去掉非 Bt DNA 片段,解决环境释放
20、安全问题,cry gene,oriBt,res,res,erm,amp,oriEc,cry gene,oriBt,res,res,erm,amp,oriEc,受体菌中发生解离,TnpI,只能在苏云金芽胞杆菌中复制,只能在大肠杆菌中复制,解离载体的解离,IRS,IRS,解离载体pBMB801的构建及解离,resolution,ori/ts,Tc,ori/E,Amp,tnpI tnpA,2.整合在染色体,转座子整合载体,三、S-层蛋白用于表面展示的前景,信号肽,SLH 锚定序列,1六聚组氨酸肽Poly(His)6,Poly(His)6)对重金属二价阳离子如镉(Cd2+)、镍(Ni2+)、铜(Cu2
21、+)、锌(Zn2+)和铅(Pb2+)等具有螯合(吸附)作用,可用于重金属污水处理目前几乎所有的表达重金属结合能力的细菌都限定在大肠杆菌,成功的重组菌在固定化之后在重金属污水处理方面，以及重金属矿物富集方面将有重要的应用潜力,金属硫蛋白具有相似作用,ctc-(6His)n融合基因的构建,6His PCR产物电泳图,1 2 3,1，100bp Ladder；2，3，6His PCR产物,EcoRIXbaISphI,EcoRIKpnIBamHIXbaISalISphI,slh,slh(6His)1,slh(6His)1,pBMB-982,pHT304,重组质粒pBMB-SHA1构建示意图,pBMB-
22、SHA1,重组质粒pBMB-SHB1构建示意图,XbaI,pBMB982-304,slh(6His)1,pBMB-SHB1,EcoRI+SalI,EcoRISalIXhoI,ctc-(6His)2融合基因的构建,slh(6His)2,EcoRISalIXhoI,EcoRISalIXhoI,EcoRISalIXhoI,ctc-(6His)3融合基因的构建,ctc-(6His)1 ctc-(6His)2 ctc-(6His)3 ctc-(6His)6 ctc-(6His)9 ctc-(6His)15,ctc-(6His)12 ctc-(6His)18,ctc-(6His)n融合基因构建示意图,1
23、2 3 4 5 6 7 8,重组质粒pBMB-SHAn酶切验证电泳图,1，/HindIII分子量标准2，pBMB-SHA18/ClaI+XhoI3，pBMB-SHA12/ClaI+XhoI4，pBMB-SHA6/ClaI+XhoI5，pBMB-SHA3/ClaI+XhoI6，pBMB-SHA2/ClaI+XhoI7，pBMB-SHA1/ClaI+XhoI8，100bp Ladder,重组质粒pBMB-SHBn酶切验证电泳图,1 2 3 4 5 6 7,1，/HindIII分子量标准；2，pBMB-SHB15/ClaI+XhoI；3，pBMB-SHB9/ClaI+XhoI；4，pBMB-SHB3
24、/ClaI+XhoI；5，pBMB-SHB2/ClaI+XhoI；6，pBMB-SHB1/ClaI+XhoI7，100bp Ladder,携带ctc-(6His)n融合基因重组菌的构建,将pBMB-SHAn系列重组质粒转入受体菌171/pBMB-CSA中将pBMB-SHBn系列重组质粒转入受体菌4Q7/pBMB-CSASDS-PAGE检测融合蛋白的表达,1 2 3 4 5 6 7 8,1 2 3 4 5 6 7 8,重组质粒pBMB-SHAn在171中表达的SDS-PAGE,1，分子量标记；2，171/pBMB-CSA；3，171/pBMB-SHA1；4，171/pBMB-SHA2；5，171
25、/pBMB-SHA3；6，171/pBMB-SHA6；7，171/pBMB-SHA12；8，171/pBMB-SHA18,1 2 3 4 5 6 7,重组质粒pBMB-SHBn在4Q7中表达的SDS-PAGE,1 2 3 4 5 6 7,1，4Q7/pBMB-CSA；2，4Q7/pBMB-SHB15；3，4Q7/pBMB-SHB9；4，4Q7/pBMB-SHB3；5，4Q7/pBMB-SHB2；6，4Q7/pBMB-SHB1；7，分子量标记。,CTC-(6His)n融合蛋白活性的检测,CTC-（6His）n融合蛋白对镍离子的吸附CTC-（6His）n融合蛋白对镉离子的吸附,CTC-（6His）
26、n融合蛋白对镍离子的吸附,检测表达了CTC-（6His）n融合蛋白的重组菌与Ni-NTA-Agarose 吸附作用用碘化丙锭对细胞染色荧光显微镜观察使用波长为532nm,Interaction Between Neighboring Histidines and Ni-NTA Agarose,含质粒pBMB-SHAn的重组菌与Ni-NTA-琼脂糖微球的吸附作用,A,171/pBMB-CSA；B，171/pBMB-SHA1；C，171/pBMB-SHA2；D，171/pBMB-SHA3；E，171/pBMB-SHA6；F，171/pBMB-SHA12；G，171/pBMB-SHA18,ABC,D
27、EF,G,含质粒pBMB-SHBn的重组菌与Ni-NTA-琼脂糖微球的吸附作用,A，4Q7/pBMB-CSA；B，4Q7/pBMB-SHB1；C，4Q7/pBMB-SHB2；D，4Q7/pBMB-SHB3；E，4Q7/pBMB-SHB9；F，4Q7/pBMB-SHB15,ABC,DEF,CTC-（6His）n融合蛋白对镉离子的吸附,定量测定采用全谱直读等离子体发射光谱仪测定使用波长为228.802nm,重组菌171/pBMB-SHAn和 4Q7/pBMB-SHBn对Cd2+的吸附作用,系列1：1，171/pBMB-CSA；2，171/pBMB-SHA1；3，171/pBMB-SHA2；4，17
28、1/pBMB-SHA3；5，171/pBMB-SHA6；6，171/pBMB-SHA12；7，171/pBMB-SHA18系列2：1，4Q7/pBMB-CSA；2，4Q7/pBMB-SHB1；3，4Q7/pBMB-SHB2；4，4Q7/pBMB-SHB3；5，4Q7/pBMB-SHB9；6，4Q7/pBMB-SHB15,2.Aii抗病蛋白在细胞表面的展示,但该蛋白为胞内蛋白，若在细胞表面表达可增强其抗病作用,ctc-aii融合基因 的构建,CGGCTCTAGACATGACCGTAAAGAAGCTTTA,aii-up:,aii-down:,AGCTGCATGCCTATGTATACTCCGGGAA
29、CA,XbaI,SphI,以pGEMT-4Q7aii为模板,aii基因及pBMB-SAII重组质粒PCR扩增产物电泳图,1 2 3,1，100bps Ladder；2，aii基因PCR产物；3，pBMB-SAII重组质粒PCR扩增产物,XbaISphI,slh,pGEMT-4Q7aii,XbaI SphI,aii,pBMB982-304,XbaI+SphI,重组质粒pBMB-SAII的构建示意图,pBMB-SAII质粒图谱,重组质粒pBMB-SAII的酶切验证电泳图,1 2 3 4,1，pBMB-SAII/HindIII；2，pBMB-SAII/SphI；3，pBMB-SAII/XbaI；4，
30、/HindIII 分子量标准,重组质粒pBMB-SAII在4Q7中的表达1，4Q7/pBMB-CSA；2，分子量标准；3，4Q7/pBMB-SAII；4，CTC,1 2 3 4,携带ctc-aii融合基因重组菌 的构建,CTC-Aii融合蛋白活性的检测,胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1,AI,致病基因表达,重组菌,分解,在马铃薯上重组菌4Q7/pBMB-SAII对胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1引发病灶的抑制作用,3 42 1,4 13 2,3 42 1,A B C,A，B，C三个平板分别代表SCG1与待测菌株混合培养0.5h、2h、4h每个平板上 1为SCG1+无菌水 2为SCG1+4Q7/pBMB-S
31、AII 3为SCG1+4Q7/pBMB-CSA 4为4Q7/pBMB-CSA+无菌水,在大白菜上重组菌4Q7/pBMB-SAII对胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1引发病灶的抑制作用,1 2 3 4 1 2 3 4,1，SCG1+4Q7/pBMB-SAII 2，SCG1+4Q7/pBMB-CSA3，4Q7/pBMB-CSA+无菌水 4，SCG1+无菌水,(2)在S层蛋白突变株中的表达,1.Saii-Tr5混合SCG1 2.Saii-4Q7混合SCG13.3439-Tr5混合SCG14.软腐病菌SCG1上图：混合80min下图：混合120min,转aiiA 融合基因菌株3439-Tr5、Saii-Tr5、Saii-4Q7的抗软腐病检测,Thanks,许朝晖张琼王莉刘欣张蕾刘小锦吴怀光周燚朱晨光,国家“863计划”国家自然科学基金教育部重点资助项目,芽胞杆菌分子生物学研究组,参考资料,考试题型,1.名词解释2.填空3.简答题4.问答题,
