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1、第三章 生物信息学的传递-从DNA到RNA(2),南昌大学生科院 彭晓珏,原核生物,3.5 真核生物的转录,真核生物的转录和原核转录的不同点：(1)原核只有一种RNA聚合酶，而真核细 胞有三种聚合酶；(2)启动子的结构特点不同，真核有三种 不同的启动子和有关的元件；(3)真核的转录有很多蛋白质因子的介入。,真核的RNA聚合酶,真核生物中的转录可以分为三类，每类转录分别由不同的RNA聚合酶执行：1.RNA聚合酶I转录rRNA，与细胞的大 部分活动有关2.RNA聚合酶II转录mRNA，结构基因，拥有最多的产物3.RNA聚合酶III转录 tRNA和其它的sRNA（small RNA）,真核的RNA聚
2、合酶,表12-2 真核生物的三种RNA聚合酶的特点RNA Pol位置 产物 相对活性 对-鹅膏蕈的敏Pol 核仁28s,18s,5.8s rRNAs 5070%不敏感Pol 核质hnRNA,mRNA,某些SnRNA 2040%高度敏感Pol 核质tRNA,5SrRNA,某些SnRNAs 10%片段特异，中等敏感 表12-3 转录的抑制剂 抑制剂 靶酶 抑制作用 利福霉素细菌全酶和亚基结合，抑制起始 链霉溶菌素细菌核心酶和亚基结合，抑制起始 放射线素D真核Pol和DNA结合，阻止延伸-鹅膏蕈真核Pol和RNA Pol结合,B220240Kda与模板结合，与链的起始，延伸有关，相 当于原核 RNA
3、 Pol的亚基C端含有羧基末端功能区 大亚基 B140150Kda与DNA、底物和新生的RNA结合，相当于原核RNA Pol B44.5酶的连接，相当于原核RNA的亚基RNA Pol ABC 27KDa 磷酸化蛋白，1类三种RNA Pol共有，如 ABC 25.5KDa 与DNA结合有关 ABC 23KDa B 12.6 小亚基 2类Pol 特有 B 23 B 14.5 B 10 3类在某些条件下可除去的亚基 B 23参与酶的基本结构 B 16.5细胞器的RNA Pol和噬菌体的RNA相似，因有单一固定的功能，分子量较小 表12-3 真核生物聚合酶的成分及功能,真核生物的启动子,真核生物细胞中
4、有三种转录方式，分别由三种RNA聚合酶(I、II和)催化，因此有三种启动子。根据启动子的不同，将真核生物的基因分为三类，即I类、II类和III类基因。这三种基因分别由三种启动子控制，它们在结构上各有特点。,3.5.2.1 真核生物的启动子II,启动子最为复杂，它和原核的启动子有很多不同：（1）有多种元件：TATA框，GC框，CATT框，OCT等；（2）结构不恒定；（3）它们的位置、序列、距离和方向都不完全相同；（4）有的有远距离的调控元件存在，如增强子；（5）这些元件常常起到控制转录效率和选择起始位点的作（6）不直接和RNA pol结合；(7)需多种转录因子介入。,真核启动子含有不同的组件,S
5、V40 早期启动子胸苷激酶组蛋白H2B-140-120-100-80-60-40-20+1 Oct CAAT GC TATA,(一)类基因的启动子和调控区,TATA框 核心元件 启始子（initiator，Inr）:一般由PY2CAPY5构成，位于-3+5，可能提供RNA pol 识别。CAAT box、类启动子 上游元件组成 GC box Oct 增强子（enhomcer）远端调控区 减弱子（dehancer）静息子（sisencer）上游激活序列（upstream activating seguences UASs）,起始子,起始点一般没有同源序列mRNA的第一个碱基倾向A，另一侧翼由Py
6、组成称为起始子（initiator,Inr).（在原核CAT起始序列也有这种情况）。一般由PY2CAPY5构成位于-3+5提供RNA pol 识别。无论TATA是否存在，Inr对启动子的强度和起始位点的选择都是重要的。现已纯化了Inr 结合蛋白。,核心元件,TATA框合又称Hogness框，Goldberg-Hogness 框，俚语 称为金砖（Goldbrick）其一致序列是：T85A97T93A85A63A83A50常在-25左右，相当于原核的-10序列。其作用是：(1)选择正确的转录起始位点，保证精确起始，故也称为选择子（selector）。(2)影响转录的速率。,.上游启动子元件（UPE
7、）,表12-4 哺乳动物RNA Pol 上游转录因子结合的元 元件保守序列结合DNA的长度 蛋白质因子TATAboxTATAAAA 10bp TBPCAAT boxGGCCAATCT 22bp CTF/NF1GC boxGGGCGG 20bp SP1OctamerATTTGCAT 20bp Oct-1OctamerATTTGCAT 23bp Oct-2KB GGGACTTTCC 10bp NFKBATF GTGACGT 20bp ATF B.Lewin:GENES.1997,Table 28.2,增强子,它是在1981年由Benerji,Rusconi小组和Chambom等发现的，又称远上游序
8、列（far upstream seguence）。其特点是：具有远距离效应。无方向性。顺式调节。无物种和基因的特异性。具有组织的特异性。有相位性。其作用和DNA的构象有关。有的增强子可以对外部信号产生反应。,增强子为什么具有远距离作用呢？（1）拓朴效应；拓朴效应说认为增强子的 作用是诱导染色质结构变化，使核小 体产生DNaseI敏感区。（2）滑动模型；（3）成环模型。Enhancer Promotor,Transcription regulate,转录因子 转录复合体TBPTAFsTFIIATFIIB TFIIF Pol IITFIIE RNA pol 的转录起始,表12-5 人类型启动子的转
9、录因子因子 分子量 功能RNAPol 10K 依赖模板合成RNATFA12,19,35K 稳定TFD和DNA的结合，激活TBP亚基TFB33K 结合模板链（-10+10），起始Pol结合，和TFE/F 相互作用TFD(TBP,30K)TBP亚基识别TATA，将聚合酶组入复合体中，TAFs识别 特殊启动子TFE34K()结合在Pol的前部，使复合体的保护区延伸到下游 57K()TFF38,74K 大亚基具解旋酶活性（RAP74）,小亚基和Pol结合，介导其加入复合体TFH 具激酶活性，可以磷酸化PolC端的CTD，使Pol逸出，延伸TFI120K 识别Inr，起始TFF/D结合TFJ 在TFF后
10、加入复合体，不改变DNA的结合方式TFS RNA合成延伸,Transcription movie,NOTE,1 II类启动子为一个上游启动子2 需要很多的转录因子（TFIIH)3 RNA POL II CTD4 TPB(TATA box),3.5.2.2 RNA pol启动子,核心启动子（core promoter）或核心元件（core element），位于-45到+20，负责转录的起始。上游控制元件（upstream,control element UCE），从-180延伸到-107，可增加核心元件的转录起始的效率。,3.5.2.3 RNA聚合酶的启动子,Pol III基因的产物为一些分子
11、量较小的细胞质 RNA（cytoplasmic RNA scRNA）包括:tRNA 5S rRNA 7SL RNA(参与细胞内蛋白质转移)U6 RNA(转录后加工)RNA polymerase III uses both downstream and upstream promoters,Pol 的启动子结构,小结,真核生物的转录(1)真核细胞有三种聚合酶；(2)启动子的结构特点不同，真核有三种 不同的启动子和有关的元件；(3)真核的转录有很多蛋白质因子的介入。,真核生物的转录,细菌的转录电镜图,3.6 转录后加工,3.6.1 原核生物mRNA加工,真核mRNA前体的加工,(一)核内不均一RN
12、A（heterogenous nuclear RNA,hnRNA）平均分子长度为8-10Kb(2Kb14Kb)左右。比mRNA的平均长 度（1.8-2Kb）要大4-5倍。hnRNA仅有总量的1/2转移到细胞质内，其余的都在核内被降解掉。hnRNA是mRNA的前体，证据是：(1)hnRNA和mRNA有相同的序列；(2)hnRNA在体外能作为模板翻译蛋白；(3)两者5端都有帽子结构；(4)表明二者为相同的聚合酶所合成；(5)两者的3端都有多聚腺苷有尾巴。,hnRNA的结构的特点,(1)5端有帽结构；(2)3端有poly（A）尾巴；(3)帽结构后有3个寡聚U区，每个长约30nt(4)有重复序列，位于
13、寡聚U区后面；(5)有茎环结构，可能分布于编码区（非重复序列）的两侧；(6)非重复序列中有内含子区。,1加帽,(1)剪接前加帽 如呼肠病毒，牛豆病毒(2)剪切后加帽 如疱疹病毒和口炎病毒,帽子 的类型,在末端鸟苷的第7位上存在单个甲基化位点的称O型帽子（capO）；在次末端核苷酸的核糖上的2-0位点上还有一个甲基位点的称1型帽子(cap 1)；此外，在第三个核苷酸的核糖上（2-0）有甲基化位点的称2型帽子（cap2）。这三种帽子都有特殊面对面核苷酸结构（confrontde nucleotide structure）。,帽子结构的功能,(1)有助于mRNA越过核膜，进入胞质；(2)保护5不被酶
14、降解；(3)翻译时供IF（起始因子）和核糖体识别。,(2)加尾,(1)特殊组分(CPSF:剪切和多聚腺苷酸化特异因子)识别AAUAAA并指导其它的活性(2)剪切因子(CF)在加尾位点 AAUAAA下游1130nt 处剪切RNA；(3)PAP末端腺苷转移酶poly(A)聚合酶合成 poly(A)尾巴；(4)PBP与poly(A)结合，反应停止。,加Poly(A)的反应,第一步加一个短的寡聚A序列（10nt），此反应依赖于AAUAAA序列；反应由poly（A）聚合酶在特殊因子指导下完成的。第二步是寡聚A尾巴延伸到240nt的长度。此反应并不需要AAUAAA序列，但需要一个识别寡聚A并指导poly（
15、A）聚合酶延伸的刺激因子。,processingmovie,3.7 表观遗传变异相关的内容：X染色体失活 DNA甲基化（methylation)染色质结构变化 基因组印记（genomic imprinting)RNA编辑（RNA editing）,3.7.1 基因组印记,20世纪80年代，McGrath 和Solter提出：对小鼠进行核移植：孤雄生殖：胎盘发育良好，胚胎发育不良 孤雌生殖：胚胎发育良好，胎盘发育不良,无法存活至分娩,人 类的两种肿瘤：完全性葡萄胎（无核卵子受孕）卵巢畸胎瘤（卵细胞自活化）,哺乳动物父本和母本的遗传信息对于胚胎的基因组的影响是不一样的，父本母本的遗传信息互补是胚胎
16、发育必须的,基因组印记（genomic imprinting）a.基因组印记与印记基因：基因组印记：指来自双亲的某些等位基因在子代中由于亲源（父源或母源）的不同而呈现差异性表达。印记基因：来自父本的等位基因不表达，而母源的等位基因表达，称为父系印记。反之，来自母源的等位基因不表达，而父源的等位基因表达，称之为母系印记。,b.印记基因的特点：,依据亲本来源，进行单等位基因表达，使两个亲本基因具有不同的功能；富含CpG岛，易于被高度甲基化修饰，说明甲基化修 饰对于印记状态的保持有重要作用；大多呈簇排列，很少单独存在，说明印记基因之间存在一种共线形的作用关系，印记区紧密联系，相互依赖 具有一个或几个
17、印记控制域，又称差异甲基化区；修饰状态在子代细胞中保持以保证基因的表达模式。,印记发生于配子的形成过程中，可以消除和重建,在胚胎的有丝分裂能稳定的遗传给体细胞,在世代交替中，印记消 失，在配子发生时重建,基因印记控制区（ICR）,基因印记控制区：基因的印记，表达，沉默受基因控制区的调控。ICR一般有几千个碱基，并且富含CpG。,P(paternal):ICR甲基化控制H19和Igf2 基因的表达M(maternal)：ICR和CTCF控制基因的表达,3.7.2 RNA干扰,1995年，Cornell大学的研究人员Guo和Kemphues研究阻断秀丽新小杆线虫中的par-1基以线虫为对象探讨用反
18、义RNA去阻断基因的表达，反义RNA的确能够阻断基因的表达，但是奇怪的是，作为对照的正义链RNA也同样阻断了基因的表达。此后另一些科学家以同时包含正义链和反义链的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）去阻断基因的表达，结果表现出比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默现象。这种由RNA导致的基因沉默现象被称为RNA干涉（RNA interference,简称RNAi）,大量研究表明，RNA干涉广泛存在于从真菌到植物、从无脊椎动物到晡乳动物的各种生物中，甚至也存在于低等的原核生物中。从遗传学、分子生物学和生化学角度进行的研究也指出转录后基因沉默（PTGS）和RNA
19、干涉可能在生命进化的早期就存在。,RNAi干扰的特点,1)放大作用:在使靶基因失活的效应中,双链RNA比单链RNA的效果更为强烈;2)传递效应：可以在体细胞世代之间传递,表现出表观遗传效应.,siRNA如何导致mRNA降解,RNAi动画,3.8转基因的常用手段,1.显微注射2.基因枪轰击3.农杆菌介导的方法,转基因植株的产生,最常用的手段是农杆菌介导的转基因的方法,在大多数的双子叶植物和少数单子叶植物中已经成熟,不需要特殊的仪器设备，任何实验室都能操作,农杆菌介导的植物转基因,农杆菌是土壤中的一种细菌，能够导致植物产生冠瘿病,农杆菌中含有 Ti质粒(Tumor-inducing plasmid
20、),Ti质粒含有T-DNA序列，T-DNA可以注射进入植物的核DNA,Ti Plasmid,T-DNA region,Auxin,Left border,Cytokinin,Opine,Opine catabolism,Right border,vir genes,ori,12-24 kbp,Plant cell,Agrobacterium,Nucleus,农杆菌介导的植物转基因,T-DNA,Ti plasmid,Plant cell,Agrobacterium,wound,T-DNA,Ti plasmid,Nucleus,农杆菌介导的植物转基因,C,CH3,O,OH,OCH3,CH3O,Ac
21、etosyringone 乙酰丁香酮,C,CH2OH,O,OH,OCH3,CH3O,Hydroxyacetosyringone 羟基乙酰 丁香酮,农杆菌介导的植物转基因,Plant cell,Agrobacterium,Nucleus,Single-stranded copy of T-DNA(protected by ssDNA binding protein),wound,Chromatin,T-DNA,pore,T-DNA,农杆菌介导的植物转基因,利用农杆菌转导的方法获得了转基因植株,T-DNA标签突变体所用载体,转基因流程图,胚性愈伤,抗性愈伤,再生植株,PCR检测阳性率70,转基因植
22、株108 株,Soil,Nutrient availability,Acidity and alkalinity,Climate,Temperature(heat;cold),Water(drought;flooding),Mechanical stimulation(wind),Applied chemicals,Herbicides,Heavy metals,Pollutants,Ozone,Light,Too much,Too little,Improving Plant Tolerance to Abiotic Stress,10%of global crop production l
23、ost through weeds,$10 billion spent on herbicides annually,Many herbicides will also kill crop-often have to be applied early as a precaution,Many herbicides persist in soil or leave toxic residues,Tillage(ploughing)can be used forweed control but:-soils can become prone to erosion after extensive t
24、illaging-serious loss of water content,Herbicides and the Problem of Weeds,Bt Toxins,Toxins produced by Bacillus thuringiensis that kill only insects,Different strains of Bacillus thuringiensis produce different toxins,each active against only one or a few insect species,Toxins produced in spores an
25、d form protein crystals,Toxins encoded by Cry genes,Bacterial spores or isolated toxins are already used as an organic insecticide,Toxins bind gut cells of insect larvae and make them leaky so larvae starve to death,Bt Crops,Crops have been transformed with different Cry genes that produce toxins ac
26、tive against that crops particular pest,Insecticide use drastically reduced on Bt crops,Genes have conferred very effective resistance,-more than 40 different Cry genes have been used to date,-yield has increased,-diversity of native insect populations has increased,promoter,Regulatory sequences rec
27、ognised by plant(either from plant gene or plant virus gene).Frequently use 35S CaMV promoter,Bt Transgenes Introduced into Plants,Codon usage modified for efficient expression in plants and to remove cryptic splice sites etc,Bt Cry,我国为转基因抗虫水稻“华恢1号”和“Bt汕优63”发放了安全证书。它们是由华中农业大学培育的高抗鳞翅目害虫转基因水稻品系。,3.9 P
28、CR 发展,1.反转录PCR（RT-PCR)2.荧光定量PCR,DNA的复制,DNA复制所需要的酶和因子 1.原料：dNTP 2.双链 DNA模板 3.引物 4.引物酶 5.解旋酶 6.单链结合蛋白 7.拓扑异构酶 8.DNA聚合酶,DNA的复制,DNA复制的过程 DNA复制的起始 DNA复制的延伸 DNA复制的终止,Invention1985,Kary B.Mullis ScienceNobel Price in Chemistry1995,for his invention of the polymerase chain reaction(PCR)method,DNA复制原理的应用PCR技
29、术,PCR技术的基本原理,PCR是指那些模拟体内DNA复制的方式在体外选择性的扩增DNA上的某个特定区段的技术。PCR在人类社会中应用广泛:DNA指纹鉴定，血液中病毒检测等PCR的4种基本要素：ssDNA模板、ssDNA引物、合成DNA的4种原料dNTP、DNA聚合酶。PCR反应的3种基本过程：变性、退火、延伸,反转录PCR：RT-PCR(reverse transcription PCR),特点：快速、简便、敏感性极高。目的：检测RNA原理：先在反转录酶作用下，以mRNA为模板合成互补的cDNA，再以此cDNA为模板进行PCR扩增。这样，低丰度的mRNA就得以扩增放大，便于检测。,实时荧光定量PCR,所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。绝对定量相对定量,奢侈基因,管家基因,伯乐公司的iCycler 系列的定量PCR仪,本次课内容结束谢谢大家！,
