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1、基因组DNA提取与PCR技术,李兆阳,前言,在基因工程和蛋白质工程中，核酸分子是这些技术应用所涉及的主要对象，所以核酸的分离与提取是分子生物学研究中很重要的基本技术。核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。,主要内容,基因组DNA提取 1、核酸的分类及理化性质 2、几种核酸提取方法的基本原理及实 例分析 3、常见问题与对策,核酸分为两大类,脱氧核糖核酸（DNA）Deoxyribonucleic Acid 核糖核酸（RNA）Ribonucleic Acid。,脱氧核糖核酸（DNA）,DNA分子含有生物物种的所有遗传信息，分子量一般都很大DNA结构,核糖核酸（RNA）,RNA主要是负责DNA遗传信息
2、的翻译和表达，分子量要比DNA小得多。RNA为单链分子。,核酸的理化性质,RNA核苷酸的纯品呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。,核酸的理化性质,天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细
3、胞中的糖，RNA 及无机离子等，从中分离DNA。,核酸的理化性质,DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。,DNA提取的几种方法(1).浓盐法,利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯化钠提取液抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起
4、摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积无水乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.也可用0.15MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿-异戊醇法除去蛋白.两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.,（2）阴离子去污剂法,SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（5565）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸,基因组DNA-SDS法,以动物组织为例,（3）苯酚氯仿抽提法,苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA联结键已断,蛋白分子表面又含
5、有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态.,（4）水抽提法:,利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积无水乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用70%、80%和95%乙醇洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品.,几种方法的比较苯酚、氯仿抽提/醇沉淀方法,是一个永不过时的方法。稳定、可靠、经济、方便。苯酚、氯仿抽提可以彻底去除蛋白质，醇沉淀可
6、以去除盐，对于一般的干净的样品(杂质为蛋白质)，该方法完全可以获得高质量的核酸。关键：酚氯仿要混匀彻底，用量足够。,浓盐法,高盐沉淀蛋白质/醇沉淀方法，同样也是一个非常不错的方法。与酚氯仿抽提方法相比，纯度的稳定性可能要低一点。更快、更轻松去除蛋白质所伴随的好处是，可以用于大规模抽提。不足是纯度(蛋白质残留)不够稳定。,水沉淀,此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.,实例分析,从鼠尾组织中提取基因组DNA,弃上清,12000rpm10min,12000rpm10min,12000rpm10min,4度保存,PK、SSTE55度,流程图,DNA中含有蛋白、多糖、酚类杂质DNA在溶解前，有
7、酒精残留，酒精抑制后续酶切和PCR反应DNA中残留有金属离子,重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质重新沉淀DNA，让酒精充分挥发后再溶解。增加70乙醇洗涤的次数（2-3次）,DNA提取常见问题,问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶切和PCR反应。,原因,对策,材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断外源核酸酶污染反复冻融,尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌将DNA分装保存于TE缓冲液中，避免反复冻融,DNA提取常见问题,问题
8、二：DNA降解。,对策,原因,实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗涤时DNA丢失,尽量选用新鲜（幼嫩）的材料适当增加用量.高温裂解时,时间适当延长，适当增加PK的用量。低温沉淀,延长沉淀时间注意动作轻柔,避免丢失。,DNA提取常见问题,问题三：DNA提取量少。,对策,原因,DNA电泳图,PCR技术,1、PCR发展历史2、PCR原理及引物设计基本原则3、常见问题与注意事项4、PCR技术的发展,PCR发展历史,PCR的设想 本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延
9、伸引物，并不断重复该过程便可克隆目的片段”。PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适的条件-模板DNA,引物,DNA聚合酶,合适的缓冲体系;DNA变性、复性及延伸的温度与时间。,一、PCR的基本原理,DNA的复制(replication)由亲代DNA合成两个相同的子代 DNA的过程。,基本原理：,在模板、引物、4种dNTP和Taq DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。,基本步骤,变性：加热使双链DNA变为
10、单链退火：降温使引物和互补模板在局部形成杂交链 延伸：耐热DNA聚合酶按53方向催化以引物为起始点的延伸反应,一、PCR的基本原理示意图,Flash演示,二、PCR引物设计PCR反应成功扩增的一个关键条件在于引物的正确设计。引物设计的总原则就是提高扩增的效率和特异性。其效率和特异性取决于两个方面，一是引物与模板的特异结合，二是聚合酶对引物的有效延伸。,1、引物长度一般为1530个核苷酸。2、引物中的碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶的堆积现象。尤其是引物的3端不应有连续3个G和C。否则会使引物在模板的G+C富集序列区错误配对。引物中G+C的含量在4555%左右。设计引物时要考虑3端和5端
11、引物具有相似的Tm值。Tm=4（G+C）+2（A+T）。引物长度要确保解链温度不低于54C3、引物自身内部不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3端的互补重叠。,（一）PCR引物设计原则,5、引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。尤其是引物3末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。6、引物3端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3端的最佳碱基选择是G和C。因为它们形成的碱基配对比较稳定。,7、引物的5端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素，荧光物质，地高辛标记，加入其它短序列包括起始
12、密码子，终止密码子等。在PCR的起始反应中，引物5端游离的碱基并不影响引导新生链DNA合成的能力。但在后续的扩增循环中，这些与初始模板不配对的序列被带到PCR产物的双链中去，所以这种引物参与的PCR反应产物，既含有目的扩增片段又含有两侧引入的核苷酸序列。,（二）引物设计的方法,现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，在线引物设计的网站有：www.cgi;http:/itsa.ucsf.edu/urolab/methprimer/index1.html;,10扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 10100pmol 模板DNA 0
13、.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul,标准的PCR反应体系,PCR反应条件的控制,PCR反应成分1.PCR反应的缓冲液：10-50mmol/L Tris-Cl 缓冲液，72 时pH7.2,调节反应体系的pH值，使Taq DNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。缓冲液含50mmol/L的KCl可促进引物退火，大于此浓度将会抑制TaqDNA聚合酶的活性。加入适量二甲基亚砜或甲酰胺有利于破坏模板的二级结构。,Taq DNA聚合酶活性需要Mg2+。Mg2+浓度过低，会显著降低酶活性。Mg2+浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。Mg2+浓度还会影响
14、引物的退火、模板与PCR产物的解链温度，从而影响扩增片段的产率。在PCR反应中，Mg2+的总量应比dNTPs的浓度高。其原因是引物、模板、dNTP分子中的磷酸基团可与Mg2+结合而降低游离Mg2+浓度，从而影响Taq DNA聚合酶的活性。常用1.5mmol/L。,2.镁离子浓度：1.5mmol/L,dNTP溶液具有较强的酸性。使用时应用NaOH将pH值调至7.0-7.5，分装小管，于-20存放，过多冻融会使dNTP产生降解。在PCR反应中，dNTPs浓度在20-200mol/L,dNTP浓度过高可加快反应速度，同时还可增加碱基的错误掺入率和实验成本。反之，低浓度的dNTP会导致反应速度的下降，
15、但可提高反应的特异性及实验的精确性。4种dNTP在使用时必须以等摩尔数浓度配制，以减少错配误差和提高使用效率。,3.底物浓度：20-200mol/L,在PCR反应中，DNA聚合酶是最关键的因素之一。PCR发明的初期使用的DNA聚合酶是Klenow片段、T4DNA聚合酶和T7DNA聚合酶，它们因对热的稳定性差而未得到广泛应用。直到耐热的DNA聚合酶(Taq DNA polymerase)应用于PCR反应，才使这一技术得到迅速发展和广泛应用。,4.耐热DNA聚合酶：2.5-5 u,TaqDNA聚合酶 Taq DNA聚合酶在75-80具有最高的聚合酶活性。75-80每个酶分子每秒可延伸约150个核苷
16、酸，70时延伸速度在60个核苷酸/秒以上。55时为22个核苷酸/秒；37和22时分别为1.5个和0.25个核苷酸/秒。温度超过80时，合成速度明显下降，可能与引物和模板结合稳定性遭到破坏有关。,Taq DNA聚合酶没有35外切酶活性。没有校正功能。对于30次循环的PCR扩增反应。此酶的错配率为0.1%0.25%。Taq DNA聚合酶体外扩增DNA的忠实性是所有已知忠实性的DNA聚合酶中最低的。因此在特别考虑扩增产物忠实性，推荐采用具有校对功能的其他耐热的DNA聚合酶。如Vent和Pfu DNA聚合酶。,Taq DNA聚合酶具有类似未端转移酶的功能，能催化dNTP加到DNA的3-OH端。但对4种
17、dNTP聚合到3-未端的能力不同，对dATP的聚合能力高于其他3种核苷酸，因此PCR产物的末端总是带有两个A。我们利用它的这种特性，在构建T载体时，在反应体系 中只加一种底物，即只加dTTP。此酶就催化在载体末端加上dT,这种载体即可直接用来克隆PCR 产物。,5.引物：0.1-0.5 mol/L PCR反应引物浓度为0.1-0.5mol/L,引物与模板的摩尔比至少为108：1。如此过量的引物才能确保模板DNA一旦变性就与引物退火，而不能与其自身退火。但引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增，且可增加引物之间形成二聚体的几率，降低扩增效率。但如果该比例太低，PCR效率也会降低。,6.模板,在
18、一定范围内PCR产量随模板浓度的升高而显著升高，但模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。为保证反应特异性，一般采用微克水平的基因组DNA或102105拷贝的待扩增片段作为模板,(二)循环参数变性温度和时间：按模板DNA复杂程度来调整变性温度和时间。94，1min；95，30 s；97，15 s；退火温度和时间：45-55，30s-1min延伸温度和时间：72，时间因扩增片段的长度而异：1kb，1min；3-4kb,3-4min循环次数：25-30次，视最初靶分子浓度而定,（三）PCR产物的积累规律,在PCR反应中，DNA扩增过程遵循酶的催化动力学原理。反应初期，目的DNA片段呈指数扩增。随着目
19、的DNA产物逐渐积累，在引物一模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和，此时扩增DNA片段的增加减慢进入相对稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩增效率、DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产物的竞争等因素。到达平台期前，TaqDNA聚合酶一般要进行25次以上PCR循环。多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。,PCR产物的积累规律示意图,PCR实验中应注意的事项,由于PCR反应极强的扩增能力和检测的灵敏性，微量样品的污染便有可能导致假阳性结果的出现.所以PCR操作过程中需要注意很多细节.,(一）PCR实验室的
20、设置 样品制备区：,这个区域专门用于制备模板，要求：PCR产物和带有待扩增序列的DNA克隆不能在这个区域操作，用于样品处理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用于操作靶序列。在提取DNA样品和RNA样品时要带手套，并要经常更换。,PCR操作区：,PCR仪应单独放在另一间实验室。另外，在PCR反应前应对准备和保持干净的PCR成分给予高度重视。所用的所有溶液应该没有核酸和核酸酶；所用PCR试剂中的水都是高质量的新鲜蒸馏水；所用试剂都应大体积配制，分装保存（一次用量）；所用吸头和试管均为一次性并是灭菌过的。所用器皿和塑料制品都要严格消毒。,反应产物分析区：,在这区域中所用的试剂，一次性器材和仪
21、器都必须专门用于PCR产物的分析，绝对不能把这一区域的试剂或仪器用于样品的制备，PCR反应前的操作。,（二）设置严格对照阳性对照：阳性DNA模板阴性对照：阴性DNA模板试剂对照：无DNA模板,（三）阴性结果应采取的措施用第一次扩增的产物作模板进行第二次扩增增加TaqDNA聚合酶的浓度增加模板量纯化模板增加扩增循环次数适当降低退火温度,（四）出现非特异性产物时应采取的措施增加退火温度减少TaqDNA聚合酶的浓度减少退火及延伸时间减少引物浓度减少扩增循环次数,琼脂糖凝胶电泳,首先根据PCR扩增片段的大小选择琼脂糖凝胶浓度，一般800bp以上的片段用0.8%的胶，800bp以下的片段用1.0%2.0%的胶。成功的PCR扩增应可见到分子质量均一的一条区带，对照分子质量标准还可对扩增产物进行半定量。,PCR产物的检测,琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是PCR扩增产物的分离、纯化和鉴定最常用的方法。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，用溴化乙锭(EB)染色，在紫外灯下便可以直接确定DNA片段在凝胶板中的位置。其分辨率很高，可测出1ngDNA。,电泳图,PCR技术建立以来，因其较高的实用性而在各个领域广泛使用。PCR方法本身又在使用中不断得到发展，形成了一系列适用不同目的的特殊方法。,PCR相关技术的发展,谢谢！,
