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1、分子生物学实验,1、欢迎大家参加分生实验的学习；2、学习分生实验的重要性；3、守纪律，听老师安排，穿白衣；4、每组做一份实验4、本课件原则上禁止拷贝，要作好记录;5、关于课间休息和上课时间每天实验结束应主动整理实验台。值日安排。,实验课考试,1.最后2学时进行实验课考试 2.开卷,但不许抄袭其它同学试卷。内容为实验课学习内容。,一、加样器的使用及注意事项 1、用途 2、如何使用？,2.1 根据取样量，选择合适的加样器。5ul、50ul、500ul，应选择哪个加样器?,顶部标有加样器的最大量程，分别为：20ul:0.5 20 l100/200ul:20 100/200 l 1000ul:200u
2、l 1000 l,实验仪器的使用及注意事项,练习：加样器读数为 100，实际体积各为多少?,2.2 如何调节？,(1)首先观察目前读数,假设为050:1000 l:500 l 100/200 l:50 l 20 l：5 l(2)顺时针调节-读数变小 逆时针调节-读数变大(3)注意：调节前加样器读数正处于最大量程或最小量程时，如果向错误方向调节，马上会超出量程，将会损害加样器的精度。,2.3 加样器使用步骤(示教及学生练习)：1）选择加样器,观察读数,调节读数，吸头的安装要紧密。不要用手直接拿吸头，安上吸头后一定要再固定一下。2）吸取液体前，先打到第一挡。3）将吸头插入液面下适当深度，过深可能会
3、腐蚀加样器,过浅可能会吸入空气。4）缓慢松开拇指,吸取液体。松开过快，液体上冲会腐蚀加样器;完全放开拇指后，停留约半秒钟,急于离开液面，容易吸入空气。5）抬起加样器,估计体积是否正确,将外壁液体用容器口引流回去6）(吸头内有液体时，不能将加样器倒置或平放，以防液体倒流损坏加样器！),贴容器内壁，将液体匀速打出，加样器推到第二挡。观察吸头内液体是否完全打出并立即弃于废物盒内.,1、打开电源 2、离心管中的液体为2/3,盖紧盖子,防止离心机被腐蚀。,二、离心机的使用注意事项,1代表转速盘上方的数据，2代表下方的数据。,3、样品配平,对称放入离心机(管的连接处朝外).4、设定离心时间(如设定2分钟，
4、可定时多点时间，再用手表记时)。5、统一离心，逐渐升到要求转速。,实验一、真核细胞基因组DNA的提取、酶切及电泳,实验目的,1.掌握人外周血基因组DNA的提取技术。2.学习酶切技术3.学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和技术。,第一部分：裂解血细胞、蛋白酶k消化第二部分:酚氯仿抽提、乙醇沉淀第三部分：酶切、DNA电泳,实验内容,（到 8：308:40）,1）取0.3ml抗凝血置于1.5ml Eppendorf管中.2）加入1ml STMT 溶液，充分混匀，静置5min，使其溶血。3）9,000rpm,离心 3 分钟(统一离心)。4）弃上清。弹管底重悬沉淀。,注意:离心时离心机内样品要平衡,实验步骤
5、,实验第一部分：裂解红细胞、蛋白酶K消化,加样器使用提示：（1）吸头的安装要紧密。（2）打到第一挡，将吸头插入液面下适当深度（3）缓慢松开拇指，吸取液体。拇指完全放开后，吸头在液面下停留一下（约半秒钟）（4）将外壁液体用容器口引流回容器。吸头内的体积应大致正确。（5）贴目的容器内壁，将液体匀速打到目的容器内，加样器推到第二挡。观察吸头内液体是否完全打出。,8：409：15,4）加 0.4ml生理盐水，悬浮细胞。5）9000rpm,离心 3分钟(统一离心)，弃上清，弹匀。,6）加460 l NE溶液，混匀。7）加30 l 10%SDS,迅速混匀。8）加50 l 蛋白酶K(20mg/ml),混匀，
6、置50C水浴1小时。,操作注意事项：1、混匀时确认沉淀已被悬起。2、注意30ul、50ul加样体积准确。,加样器使用提示：（1）吸头的安装要紧密。（2）打到第一挡，将吸头插入液面下适当深度（3）缓慢松开拇指，吸取液体。拇指完全放开后，吸头在液面下停留一下（约半秒钟）（4）将外壁液体用容器口引流回容器。吸头内的体积应大致正确。（5）贴目的容器内壁，将液体匀速打到目的容器内，加样器推到第二挡。观察吸头内液体是否完全打出。,一、核酸提取的主要步骤,课间介绍,真核细胞基因组在提取过程中一般有以下几步:1)破碎细胞；2)去除蛋白质，糖类等生物大分子；由于真核细胞基因组较大，在纯化出的的操作中应注意动作轻
7、柔，且在低温下进行，以最大限度地减少机械和化学作用对的剪切，从而获得相对完整的3)沉淀核酸,乙醇沉淀,SDS裂解蛋白酶K消化,琼脂糖电泳,PCR,DNA提取步骤图解,酚氯仿抽提,1、STMT 溶液：四种成份的英文缩写 S:Sugar 8%T:Triton X-100 1%M:MgCl2 0.5mM T:Tris-HCl 10mM(PH:8.0)作用：用Triton 细胞膜上打孔，裂解细胞。从末梢血中提取DNA主要是从白细胞中提取。（而红细胞经过溶血处理后都已经裂解）。,二、各种试剂的作用,作用：a.阴离子型去污剂，溶解细胞膜、核膜上脂质成分 b.使蛋白质变性 c.将细胞膜、核膜破坏；对核酸酶有
8、抑制作用,N:NaCl 50mME:EDTA.Na2 25mM(PH:8.0)作用：金属离子螯合剂，抑制DNase的活性(螯合DNase发挥活性所需的2价阳离子)。,二、各种试剂的作用,1、NE 溶液：,2、SDS：十二烷基硫酸钠 终浓度0.5%,3、蛋白酶K(或链霉蛋白酶),是广谱蛋白酶，能在SDS和EDTA的存在下保持很高的活性，降解蛋白质，将DNA游离。,重蒸酚:酚的作用是变性蛋白质，而对DNA结构没有影响。无色 酚的氧化产物(如醌等,粉红色)破坏磷酸二脂键。重蒸酚是将酚中的酚的氧化产物去除。TE溶液:Tris-HCl 10mM(pH:8.0)EDTA.Na2 1mM(pH:8.0)作用
9、：提供略碱的pH值，保证DNA溶于水相。在酸性条件下，DNA分配于有机相。8-羟基喹啉：0.1%黄色 酚相指示剂 抗氧化剂,作用：去除蛋白等杂质。酚对蛋白有强烈的变性作用，用酚和氯仿抽提样品，可以使样品中的蛋白质变性沉淀，可通过离心去除。为防止其对后续实验的影响，一般再用氯仿抽提去除残留的酚。,4、TE饱和重蒸苯酚：,氯仿作用：a.氯仿的变性作用不如酚好，但与酚共同/交替使用可增强去蛋白效果；b.氯仿有加速有机相和水相的分离、去除植物色素和蔗糖、抑制核酸酶活性；,5、酚/氯仿,6、氯仿/异戊醇(24:1),氯仿的作用：去除DNA水溶液中残留的微量酚。异戊醇的作用：减少操作过程中气泡的产生。,在
10、单价阳离子存在的情况下，乙醇可以使DNA发生沉淀。可离心收集.核酸是多聚阴阳离子的水溶性化合物，能与很多阳离子形成盐类而沉淀，在许多种有机溶剂中不溶解，也不会被变性。最常用沉淀剂为1价钠、钾、胺和锂等离子的盐类，如醋酸钠、NaCl、氯化锂、氯化钾等常用有机沉淀剂有：乙醇、异丙醇、聚乙二醇、精胺等。,8、无水乙醇：,作用：提供单价阳离子。,7、醋酸钠：3M NaAc pH:5.2,课间休息,同学自己练习：,加样器使用提示：（1）吸头的安装要紧密。（2）打到第一挡，将吸头插入液面下适当深度（3）缓慢松开拇指，吸取液体。拇指完全放开后，吸头在液面下停留一下（约半秒钟）（4）将外壁液体用容器口引流回容
11、器。吸头内的体积应大致正确。（5）贴目的容器内壁，将液体匀速打到目的容器内，加样器推到第二挡。观察吸头内液体是否完全打出。,十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。蛋白酶K。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得总DNA溶液。,10:00上课,1、加入550ul(等体积)TE饱和酚,混匀1min.10,000
12、rpm,2 min。(注意抽取下层酚相;酚可腐蚀加样器等,加样器头用过即弃掉)(轻柔混匀，避免DNA链断裂;但是太轻又起不到变性蛋白的作用)2、将上层水相移至一新管中(要尽量抽尽，又不可吸起酚相)。加入500ul(等体积)酚/氯仿(已经配好，体积比1:1),同上条件混匀、离心。3、将上层水相移至一新管中。加入500ul(等体积)氯仿-异戊醇，同上条件离心、取上清。4、加入1/10体积（约30ul）醋酸钠于上清中充分混匀。加入2-2.5倍体积无水乙醇（约1ml）（通常加满小离心管），混匀后交给老师，（统一置）-20 1 h(或-70 10 min)。,实验第二部分、酚氯仿抽提DNA及乙醇沉淀,注
13、意事项：1）本实验将用到的TE饱和重蒸苯酚、氯仿/异戊醇是有机试剂，比水的比重大，而DNA溶解在水里，我们总是取上清；2）在抽取完苯酚、氯仿等有机试剂尤其不能将加样器平放或倒置，以防液体导流损坏加样器，加完样后立即弃掉加样器头。3）基因组DNA由于太大，非常容易受机械剪切而断裂，因此，为了得到完整的基因组DNA，尽量不要多次进行物理性操作，如用加样器反复吹打等，有时需要将加样器头尖剪断，以防由于太细造成基因组DNA通过狭小通道而断裂。,乙醇沉淀后午休。,注意事项：双蒸水溶解沉淀要充分。,加入13 l 双蒸水,溶解沉淀，-20保存。,6、10,000 r/min 离心 5 min，弃上清(倒)。
14、10,000 r/min 离心 1 min，弃上清(吸)。7、用滤纸条吸干管内壁液体(不要触及DNA沉淀)，室温干燥10 min，观察DNA沉淀的颜色。,8 l：酶切、电泳,余 5 l：PCR模板（下次课进行）。,9、基因组DNA的酶切：基因组DNA 8 ul 10 x Buffer H 1 ul EcoR I(最后加入)0.6 ul 置 37 保温 45 min。,实验第三部分：基因组DNA的酶切,1:002:20,课间介绍（2）：1.酶切相关知识,1、酶活性单位 Unit（U）：1U:是指在1小时内，适当温度下(37C)，在50ul 反应体系中，将1ug of lambda DNA(底物D
15、NA)完全消化所需的酶量。2、酶切体系：10反应缓冲液：提供内切酶反应最适 pH值及所需离子。双蒸水：无细菌和其他酶类污染。BSA：100-200ug/ml，保护酶蛋白不失活。内切酶：含50%甘油，-20保存。反应体积：一般根据底物DNA的量来计算。反应体系中甘油浓度应5%。,1.Southern blot DNA水平基因结构分析的重要策略之一.基因组DNA酶切电泳后可以直接用于Southern blot 转膜。2.构建基因组文库3.PCR的模板 克隆表达基因 分析基因一级结构的变化 基因组PCR产物的酶切电泳可以分析基因多态性；利用内参法可以相对定量分析特定基因在基因组上的拷贝数。,课间介绍
16、 提取模板DNA的常见目的：,由于基因组DNA的链很长，常用的蛋白酶K酚抽提法由于机械剪切力的作用，很难获得完整的DNA分子,可获得100kb-150kb大小的DNA片断，可满足下述实验用途。,DNA琼脂糖凝胶电泳,1.内切酶消化后的DNA片段,琼脂糖凝胶,取下硝酸纤维素膜,标记探针,杂交袋,4.将硝酸纤维素膜放入杂交袋中,预杂交;杂交:与标记的核酸探针;洗膜,放射自显影后的X光底片,将硝酸纤维素膜与X-光片曝光,2.变性 中和3.转膜,5.放射自显影或显色,Southern Blot 基本过程,实验第四部分、DNA质量检测 琼脂糖电泳,一、原理,DNA分子在 pH 8.0 的电泳环境中，带负
17、电荷，在一定强度电场力的作用下，从负极向正极迁移。电泳样品载体琼脂糖是一种线性多糖聚合物，煮沸冷却后形成网格样结构，电泳中起分子筛作用。通常情况下，分子量大的DNA电泳过程中由于受到的阻力较大，泳动速率较慢，反之，分子量较小的DNA片段跑在前面。,二、常用试剂,上样液成份：10.25%溴酚蓝或/和0.25%二甲苯青（样品指示剂）240%蔗糖 或 30%甘油（增加样品比重），利于加样。电泳缓冲液：TAE 为例 T:Tris碱 A:冰醋酸 E:EDTA 提供有一定缓冲能力的pH值(8.0),EDTA可抑制DNase 的作用。溴化乙锭（EB）：染色剂 一种荧光染料，分子呈扁平型，可嵌入到DNA或RN
18、A 的碱基之间。在紫外光激发下能发出红色的荧光。,致癌剂,重点强调溴乙锭的危害！,1%琼脂糖凝胶电泳。在样品中加 23ul 6上样液，混匀，加入上样孔内 电泳条件：100110伏，30-40分钟。电泳结束后照像保存，结果分析。,上样时老师先加，再委派技术好的学生帮老师加。各组按顺序上样，老师在一旁指导上样。,三、操作,80分钟。（2:203:40),线性DNA片断大小（kb）琼脂糖浓度（%）5 60 0.4 0.8 10 0.7 0.4 6 1.0 0.2 4 1.5 0.2 3 1.75 0.1 3 2.0,凝胶的浓度不合适时电泳会出现什么现象？,四、琼脂糖凝胶的浓度,五、电泳仪的使用方法,
19、稳压:电流旋钮调到最大，再根据需要调节电压。如箭头所示。,用内切酶酶切基因组，电泳结果可出现连续的、弥漫云雾状带，称 Smear 带。识别 6bp序列的内切酶，平均每4096 bp长度出现一次切割概率。,如果Smear带密度比较均匀，说明酶切效果比较好，可用于Southern Blot 实验。,六、预期结果,1 2 3 4 5,Marker,总DNA,未酶切的基因组,思考题：1.本实验中所用到的各试剂的作用是什么?氯仿,乙醇,EDTA2.DNA提取过程中应注意什么？,由于基因组DNA的链很长，在实验中由于机械剪切力的作用，很难获得完整的DNA分子。常用的蛋白酶K酚抽提法可获得100kb-150kb大小的DNA片断，可满足上述实验用途。,基因组DNA一般用于：Southern杂交、构建DNA文库 或用于PCR反应的模板。,实验结束后整理实验台,值日生值日!,总结：提取基因组DNA的常见目的,
