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1、质粒DNA的提取和鉴定,实验一,一、目的与要求,1.掌握碱裂解法提取质粒的方法及原理 2.了解用分光光度计测定DNA含量的方法3.了解“过柱”快提质粒DNA,二、相关知识及原理,质粒(Plasmid)：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。,质粒（plasmid）,是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等,质粒的复制：严紧型
2、复制（1n个）松弛型复制（20个以上）,细菌质粒:细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1Kb-200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组DNA的同一组酶系。,DNA超螺旋结构,常用的质粒载体,是通过DNA重组技术构建而成的。pUC18,pUC19,严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷
3、贝数。,质粒类型：,质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。载体(Vector)：用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制与表达的质粒(运载工具)。,载体具备的条件：合适的容量在受体细胞中可以独立复制；易于鉴定；易于筛选；易于制备；易于导入受体细胞。,启始复制子（ori,Origin of replication)；多克隆位点(MSC,Multiple cloning site or polylinker)；标记基因(Marker gene,such as LacZ gene)。抗性基因（Antibiot
4、ic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene,Kanamycine resistance gene),载体的结构：,三、实验原理,碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们，在碱性PH，DNA变性，恢复中性时，线性染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶而沉淀。几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNA分子相对较小和共价闭合环状这两个特性。由于操作原因提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。,碱裂解法,基
5、本原理：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来,DNA 是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA复性。SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。,实验原理：,实验过程 1.利用变性后状态不同：在 pH 12.012.6 碱性
6、环境中，细菌的线性大分子量染色体 DNA 变性分开，而共价闭环的质粒 DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。2.利用溶解度的不同：将 pH 调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体 DNA、大分子量的 RNA 和蛋白质在去污剂 SDS 的作用下形成沉淀，而质粒 DNA 仍然为可溶状态。3.利用离心力的不同：通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体 DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，4.利用酚变性结果不同：然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒 DNA。,释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组
7、DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。,细菌裂解的方法：碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS煮沸裂解法:沸水煮沸40秒SDS裂解法：10%SDS,一般用于质粒大量提取。,提纯的思路,质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA要去除的物质：蛋白 基因组DNA 脂类及小分子杂质 RNA 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA),质粒DNA的提取方法,方法：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析
8、法，质粒DNA释放法；酸酚法等。概括起来主要是用非离子型或离子型去污 剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理,选择哪种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术 实验要求,四、实验仪器、材料与试剂,（一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅（二）材料：含pUC19质粒的大肠杆菌、LB液体培养基，氨苄青霉素（三）试剂：溶液I作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活 溶液II作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性。溶液III作用：酸性下质粒DNA复性，变性蛋白SDS线性 DNA沉淀，K可中和DNA,平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）作用：氯仿
9、可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有机相，酚的密度大），可使DNA在上清中。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫）。注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀 TE缓冲液：溶解DNA,五、实验步骤（一）细菌培养与质粒扩增,1.挑单克隆E.coli菌株接种到斜面培养基上（活化菌种），37过夜培养 2.从斜面培养基上挑E.coli菌株，接种于25毫升 液体培养液内（含氨苄青霉素），37振荡，250 r/min 过夜培养。3.从中取4毫升种子菌液于含 LB 培养基中（含 Ap），37振荡培养3-4小时（OD6001.
10、0）。,（二）质粒提取,取1.5ml培养物倒入Eppendorf管中，12000r/min，4，30sec。吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥将细菌沉淀悬浮于100l预冷的溶液I中，剧烈振荡。,4.加200L溶液II（新鲜配制），盖紧Eppendorf 管，快速颠倒5次，混匀内容物，将 Eppendorf 管放在冰上。5.加入150L溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min 6.12 000r/min，离心5min，将上清夜转至另一Eppendorf管中。,7.向上清夜加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置5-10min。12000r/min离心5min。倒去上清夜，把Ep
11、pendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。8.用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清夜，真空抽干或空气中干燥。9.50L TE缓冲液，使DNA完全溶解（-20保存）。,用移液器操作时，每一步都要格外小心，特别是在加入溶液II 和III后，一定不要剧烈振荡，以免切碎DNA(包括质粒DNA和基因组DNA)！,（三）实验步骤流程,接含pUC18(或pET21a)质粒的单菌落于3ml LB Amp+液体培养基中370C，190rpm振荡培养过夜取1.5菌液入1.5ml的dorf管中 6000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体100L溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温（或冰浴）1
12、0min加入200L溶液II（轻轻混匀），冰上静置5min裂解菌体,加入150L溶液III（轻轻混匀），冰上静置15min质粒DNA复性12000r/min，离心15min，取上清记录体积到一新管上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（振荡混匀）12 000r/min，离心15min，取上清记录体积到一新管（可省略）上清加等体积的氯仿：异戊醇（振荡混匀）12000r/min，离心15min，取上清记录体积到一新管上清加2倍体积的无水乙醇（充分混匀），冰浴 30min,12 000r/min，离心15min沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（振荡混匀、离心）12 000r/min，离心10min沉淀超净台中风干沉淀用 20l RTE溶解，-200C保存,思考题 染色体DNA与质粒DNA分离的主要依据是什么？参考答案 当加热或用酸、碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却和回到中性pH时即恢复其天然构象 纯化DNA的方法主要依据染色体DNA比质粒DNA分子大得多，而且染色体DNA被断裂成线状分子，但质粒DNA为共价闭环结构，,实验报告目的与要求实验原理材料与方法结果与讨论,谢 谢,
