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1、,1,免 疫 学 实 验 课贵阳医学院免疫学教研室,2,1、试管凝集反应（示教）2、ABO血型鉴定-玻片凝集反应（1份/1人）3、乙型肝炎病毒表面抗体检测-ELISA法(1份/1人）,实 验 内 容,3,实验二 凝 集 反 应（Agglutination）,4,实验原理 颗粒性抗原（细菌、细胞等）与相应的抗体，或可溶性抗原/抗体吸附于与免疫无关的载体，形成致敏颗粒，与相应抗体/抗原在一定的条件下，形成肉眼可见的凝集小块的反应，称为凝集反应。参与反应的抗原称凝集原（agglutinogen），抗体称为凝集素（agglutinin）。,5,凝集反应类型,直接凝集反应（direct agglutin
2、ation）颗粒性抗原与相应抗体直接结合，所出现的凝集现象，包括试管凝集反应、玻片凝集反应。间接凝集反应（indirect agglutination）将可溶性抗原（或抗体）吸附在与免疫无关的载体颗粒表面，使此形成致敏颗粒，然后再与相应抗体（或抗原）混合，在适当条件下，发生凝集现象，称为间接凝集反应或被动凝集反应。,6,7,操作步骤于试管架上列7支试管。1.每管内分别加入生理盐水0.5ml。2.血清稀释：第一管加入1:10待检血清0.5ml，混匀 后取0.5ml，加入第二管内，依此类推，直到第6管，混匀后从第6管中吸出0.5ml弃去；第7管为对照管。,0.5ml,0.5ml,0.5ml,0.5
3、ml,0.5ml,0.5ml,（一）试 管 凝 集 反 应,1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640,8,3.每管加伤寒杆菌“H”抗原0.5ml。4.混匀，置 52水浴4h，取出后，置 室温过夜，次日读取凝集效价。,9,结 果 观 察,不同程度的凝集现象：液体澄清，细菌全部凝集（100%），沉于 管底形成大片凝集物。：液体基本澄清，细菌大部分凝集（75%左右），管底的凝集物稍小。：液体半澄清，稍显浑浊（凝集物50%左右），但仍可见明显凝集块。：液体浑浊，无凝集块，轻摇试管，有细菌呈 线状浮起。,10,效价：抗原抗体反应时，发生明显反应的最高血清稀释度，又称滴度。凝集效价
4、：凝集反应时，能使50%或以上的抗原发生凝集的最高血清稀释度。,11,（二）玻片凝集反应,已知抗血清与未知颗粒性抗原置于清洁玻片上，在一定的条件下，若两者相对应，则会发生凝集。本方法主要用于抗原的定性分析，如菌种鉴定、ABO血型鉴定等。,ABO血型系统,12,13,ABO血型鉴定步骤,红细胞悬液的制备（用于血型鉴定及ELISA实验）1.取EP管1支，加入5滴生理盐水 2.消毒耳垂或手指皮肤 3.用采血针采1-2滴血，加入盛有生理盐水的EP管中混匀 4.2000rpm，离心3min,5.取红细胞悬液用于ABO血型鉴定6.取已加有抗A血清与抗B血清载玻片1张，分别加入待测抗原各1滴，并用牙签混匀。
5、7.置室温5 分钟左右观察结果。,取上清用于ELISA实验,ABO血型鉴定的判断,示 意 图,15,注意事项,用牙签研磨时，注意防止将抗A血清带到抗 B血清中，反之亦然。如果凝集现象不太明显时，可用显微镜观察。,16,免疫标记技术,将已知抗体或抗原标记上易示踪物质（如酶、荧光素、放射性同位素、胶体金等），通过检测标记物来反映有无抗原抗体反应，从而测出微量的抗原或抗体。,17,实验五 酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbsent Assay,ELISA）,【原理】利用标记技术将酶标记到抗体（抗原）上，使待检物中相应的抗原（抗体）与酶标记抗体（抗原）发生特异性反应。在
6、遇到相应的酶底物时，酶分解底物，生成有颜色的产物。根据颜色的深浅,可以判断待检物中有无特异的抗原（抗体）以及量的多少。检测方法有直接法、间接法、双抗体法和抗原竞争法。,18,直接ELISA,包被(未知抗原）,加入酶标抗体,洗板,加底物,加终止液,包被(已知抗原）,加入待检标本（未知抗体）,加入酶标第二抗体 抗抗体,洗板,加底物,加终止液,间接ELISA,双抗体夹心法,包被(已知抗体）,加入待检标本（未知抗原）,加入酶标抗体,洗板,加底物,加终止液,19,乙型肝炎病毒表面抗体的检测 间接ELISA法,【测定原理】采用纯化HBsAg包被反应板，加入待检标本，当标本中存在抗-HBs时，该抗体与包被HBsAg结合，再加入酶标羊抗人IgG抗体。最后形成HBsAg-抗HBs-酶标抗抗体复合物，加入底物产生显色反应。,20,无菌采血，离心2000rpm,3min，取上清作为待测标本(见玻片凝集实验),每孔加入酶结合物1滴，37孵育30min,反应板中各加入待测标本1滴，同时设阴性、阳性、空白对照孔(NS)（反应板已用纯化HBsAg包被）,手工洗板，弃液拍干，重复5次,每孔加入显色剂A液、B液各1滴，置37孵育15分钟,每孔加入终止液1滴，混匀,目测法：与阳性和阴性对照比较，观察颜色深浅判断结果,【步骤】,21,实验报告,玻片凝集反应-ABO血型鉴定酶联免疫吸附试验间接法（间接ELISA）,
