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1、任课教师：齐云峰,细胞生物学实验,荧光显微镜的使用,实验二,实验目的,掌握荧光显微镜的结构、原理及其使用方法。,实验用品,荧光显微镜及荧光装置附件。人口腔上皮细胞装片，植物茎部组织装片。,实验原理,荧光显微镜是一种较为常用的光学显微镜。它是由光源、滤色镜系统和光学系统等主要部件组成。其基本原理是利用一定波长的激发光对样品进行激发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。,透射荧光显微镜的构造,吸收滤色镜,暗场聚光镜,激发滤色镜,汞灯箱,透射荧光显微镜原理,目镜,吸收滤色镜,物镜,暗场聚光镜,激发滤色镜,汞灯,透射荧光显微镜原理,反射荧光显微镜原理,汞 灯
2、,激发滤色镜,分色镜,吸收滤色镜,物 镜,标 本,实验原理,某些物质经波长较短的光照射后，分子被激活,吸收能量后呈激发态。其能量部分转化为热能或用于光化学反应外，相当一部分则以波长较长的光能形式辐射出来，这种波长长于激发光的可见光称为荧光。荧光显微镜是利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像。,什么是荧光?,物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。,保持固有的荧光特性荧光波长激发波长荧光强度极小于激发光的强度有不同程度的衰减荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率,荧光的性质,优
3、点：检出能力高对细胞的刺激小能进行多重染色用途：物体构造的观察荧光的有无、色调比较进行物质判别发荧光量的测定对物质定性、定量分析,荧光显微镜的优点和用途,荧光光源的作用,荧光光源不是作为照明的，而是作为荧光色素产生荧光的激发光。,实验原理,荧光有两种类型，一种是标本自身的原有荧光（自发荧光），另一种是利用荧光色素和细胞的特定部分反应所产生的荧光（次生荧光）。自发荧光：在生物的某些组织中，经紫外线照射后能直接发射出荧光的称为自发荧光（或直接荧光）。如植物组织中的叶绿素，经紫外线照射后，即可发出红色荧光。次生荧光：有些生物组织经紫外线照射后，并不能发出荧光，但是当它吸收荧光染料后也可以产生荧光，称
4、为次生荧光（或间接荧光）。如吖啶橙，DAPI均可检测细胞内的核酸。,荧光显微镜的基本结构组成,一、光源由于标本发出的荧光和激发光相比，是非常微弱的，因此荧光显微镜的光源强度必须很高，所以对于荧光显微镜的光源我们通常采用高压汞灯。汞灯能以最小的表面发出最大数量的紫外光和蓝光，且光亮度大，光度稳定。它是用石英玻璃制作，中间呈球形，有两个钨电极，内充一定数量的汞和少量氩氖混合气体。,一、光源,工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高，当水银完全蒸发时，可达5070个标准大气压力，这一过程一般约需515min。超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过程中发射光量子的结果。它
5、发射很强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物质。超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必须有良好的散热条件，工作环境温度不宜太高。,200W超高压汞灯的平均寿命，在每次使用2h的情况下约为200h，开动一次工作时间愈短，则寿命愈短，如开一次只工作20min，则寿命降低50%。因此，使用时尽量减少启动次数。灯泡在使用过程中其光效是逐渐降低的。灯熄灭后要等待冷却才能重新启动。点燃灯泡后不可立即关闭，以免水银蒸发不完全而损坏电极，一般需要等15min。,一、光源,超高压汞灯（100W或200W）光源的电路和包括变压、镇流、启动几个部分。在灯室上有调节灯泡发光中心的系统，灯泡球部后面安装有镀铝的凹面反射镜
6、，前面安装有集光透镜。由于超高压汞灯压力很高，紫外线强烈，因此灯泡必须置灯室中方可点燃，以免伤害眼睛和发生爆炸时造成操作。,一、光源,滤色镜按用途或功能，主要分为两类：1、激发滤色镜（exciter filter）对于光源发出的混合光，选择透过能使标本产生荧光的特定波长的光，同时阻挡对激发荧光无关的光。荧光染料均有一定的吸收光谱（激发峰值），利用滤色镜对光线选择吸收的能力，选用其透射光谱，恰为荧光染料的最大吸收光谱（激发峰值）的激发滤色镜，以便从汞灯发出的广谱光波中，选择透过最宜波段的光线供用。,二、滤色镜系统,2、阻挡滤色镜（barrier filter）阻挡滤色镜是用来阻挡掉没有被标本吸收
7、的激发光和某些波长较短的光线以及没有被选择透过的荧光，以防伤害眼睛。阻挡滤色镜的选用，应视荧光染料的荧光光谱而定，要能够最大限度的透过所需荧光并阻断短波光以及不需要波长的荧光。,二、滤色镜系统,滤镜一般都以基本色调命名，前面字母代表色调，后面字母代表玻璃，数字代表型号特点。如德国产品（Schott）BG12，就是种蓝色玻璃，B是蓝色的第一个字母，G是玻璃的第一个字母；我国产品的名称已统一用拼音字母表示，如相当于BG12的蓝色滤镜名为QB24，Q是青色（蓝色）拼音的第一个字母，B是玻璃拼音的第一个字母。不过有的滤镜也可以透光分界波长命名，如K530，就是表示阻挡波长530nm以下的光而透过530
8、nm以上的光。还有的厂家的滤镜完全以数字命名，如美国Corning厂的NO.5-58，即相当于BG12。,二、滤色镜系统,3、二向色镜（DM）二向色镜位于汞灯激发滤色镜构成的平行光轴与目镜和物镜构成的竖直光轴的两轴垂直相交处,斜向安装于光路之中。与照明光路成45角，承担色光的分流作用。二向色镜对激发光波长的光（即透过激发滤光片的光），有很高的反射率。而对由标本发出的荧光波长区的光，则有很高的透射率，即二色向镜起着反射激发光和透过荧光的重要作用。,二、滤色镜系统,一个滤光镜系统（即一个滤光块）由激发滤色镜、二向色镜、阻挡滤色镜（三部分组成。通过以上激发滤光片、二向色镜、阻挡滤光片的相应组合，可以
9、形成多种不同的激发方法，如紫外（UV）、紫（V）、兰（B）和绿（G）等（这些名称是以激发光主波长的颜色而定的）。尼康所提供的滤光块种类很多，按客户要求选择配套。,二、滤色镜系统,荧光显微镜按激发光对样品的激发方向或方式，分有两种：1透射式荧光显微镜2反射式（落射式）荧光显微镜,三、荧光显微镜的光路,激发光束通过聚光器穿过标本材料来激发荧光的，诱发的荧光从物镜前方进入物镜。这是比较旧式的荧光显微镜。其优点是低倍镜时荧光强，而缺点是随放大倍数增加其荧光减弱，所以对观察较大的标本材料较好。,1透射式荧光显微镜,透射荧光显微镜原理,目镜,吸收滤色镜,物镜,暗场聚光镜,激发滤色镜,汞灯,透射荧光显微镜原
10、理,透射荧光显微镜的构造,吸收滤色镜,暗场聚光镜,激发滤色镜,汞灯箱,这是近代发展起来的新式荧光显微镜，是激发光从物镜后部进入物镜，向下落射样品，激发出荧光，荧光反射向上再进入物镜。,2反射式荧光显微镜,反射荧光显微镜原理,汞 灯,激发滤色镜,分色镜,吸收滤色镜,物 镜,标 本,反射荧光显微镜的构造,吸收滤色镜激发滤色镜,分色镜,汞灯,紫外线保护罩,孔径光栏（FS）视场光栏（AS）,反射式荧光显微镜原理,落射光激发的荧光法是近代显微镜检术中新发展出来的一种强有力的反差增强法。它将激发荧光用的光源改在物镜的上方，光由物镜上方经反光镜射入物镜去激发样品，从样品上被激发的荧光经物镜成像并穿透反光镜而
11、由目镜观察。,如换用不同的激发滤片双色束分离器阻断滤片的组合插块，可满足不同荧光反应产物的需要。此种荧光显微镜的优点是视野照明均匀,成像清晰,放大倍数愈大荧光愈强。,2反射式荧光显微镜,透 射 式,落 射 式,四、荧光显微镜使用方法,1打开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才能达到最亮点。2透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所要求的激发滤片，在物镜的后面装上相应的阻断滤片。落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片二向色镜阻断滤片的插块。,3.用低倍镜观察，根据不同型号荧光显微镜的调节装置，调整光源中心,使其位于整个照明光斑中央。4.放置标本片，调焦后即可观察。使用中应注意：未装滤光
12、片不要用眼直接观察，以免引起眼损伤；用油镜观察标本时，必须用无荧光的特殊油镜；高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需经5分钟后才能再启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。,四、荧光显微镜使用方法,荧光观察的基本调整步骤,调整汞灯象，让其聚焦对中心。调整步骤：（1）将调心工具旋在空出的物镜转换器孔上，并让其进入光路。（2）打开前光闸，让落射光进入光路。（注：调汞灯象中心时，一般采用B波段的滤光块）（3）通过调心工具的观察窗口，将汞灯象聚焦对中心a.当泵灯象在投影平面的外部时，旋动位于灯室外部的横向和纵向的调中心旋钮将汞灯象（尚未聚焦）接近投影平面中心。b.再旋动位于灯室外部的聚焦旋钮，使汞灯象聚焦在投影
13、平面上。c.再次旋动横向和纵向调中心旋钮，将汞灯象最终清晰地固定在中心。（4）旋下调心工具，重新旋上物镜。让标本进入光路，选择适当波段滤光块进入光路，并用10X物镜聚焦。对目镜进行适度和瞳距调节。视场光阑对中心。转换所需倍率的物镜观察标本。,荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别：1.照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上；2.光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜；3.有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人眼。,荧光素的特性,口腔上皮细胞,口腔上皮细胞 荧光,松树茎部横切面,松树茎部横切面 荧光,松树茎部横切面,松树茎部横切面 荧光,向日葵茎部横切,向日葵茎部横切 荧光,头发,头发 荧光,荧光显微镜要在光线尽量暗的环境下观察。使用荧光显微镜时要注意不要直接观察激发光源，保护眼睛。,五、注意事项,实验报告,实验目的实验用品实验原理（荧光显微镜的原理）实验方法（荧光显微镜的操作方法）思考题,1、什么是荧光？它是怎样发生的？2、荧光显微镜为什么要以汞灯为光源？3、激发滤色镜和阻断滤色镜的功能及区别？4、描述样品在荧光显微镜下与光学显微镜下观察效果的差异。,六、思考题,
