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1、Central Laboratory of Biology,实验四 油镜的使用及细菌革兰氏染色法,微生物学实验,课前提问与目的要求,【课前提问】,1.油镜的特点及使用范围是什么？2.革兰氏染色的原理是什么？,【目的要求】,1.学习并掌握油镜的原理和使用方法；2.了解革兰氏染色原理；3.学习并掌握革兰氏染色的方法。,【基本原理】,1.油镜提高分辨率油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间是隔一层油质。如香柏油的折射率n=1.52，与玻璃相同。光线通过不减低视野的照明度；更主要能增加数值孔径，提高显微镜的放大效能。分辨率=/2NA=光波波（物镜的数值孔径值）NA=nsin=镜口角的半数可知n（介质折
2、射率）对提高显微镜的分辩力起着关键性的作用。,2.革兰氏染色革兰氏染色法可将细菌分成革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（G-）两种类型，细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。首先利用草酸铵结晶紫初染，所有细菌都会着上结晶紫的蓝紫色。然后利用卢戈氏碘液作为媒染剂处理，由于碘与结晶紫形成碘-结晶紫复合物，增强了染料在菌体中的滞留能力。之后用95%乙醇作为脱色剂进行处理时，两种细菌的脱色效果不同。,【基本原理】,革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚糖含量高，壁厚且脂质含量低，肽聚糖本身并不结合染料，但其所具有的网孔结构可以滞留碘-结晶紫复合物，现在一般认为乙醇处理可以使肽聚糖网孔收缩而
3、使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体保持原有的蓝紫色。而革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖含量低，交联度低，壁薄且脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，细胞壁通透性增加，原先滞留在细胞壁中的碘-结晶紫复合物容易被洗脱下来，菌体变为无色，用复染剂（如番红）染色后又变为复染剂颜色（红）。,【基本原理】,图4-1 革兰氏阳性菌和阴性菌细胞壁比较,【实验用品】,菌种：大肠杆菌16h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，金黄色葡萄球菌16h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。试剂：革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈氏（Lugol）碘液，95%乙醇，番红复染液等。仪器和其他用品：酒精灯，载玻片，显微镜，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜
4、纸，接种环，试管架，镊子，载玻片夹子，载玻片支架，滤纸，滴管和无菌生理盐水等。,【方法步骤】,1.涂片：将大肠杆菌（16h）和金黄色葡萄球菌（16h）分别涂片、干燥、固定。2.染色：1）初染：加草酸铵结晶紫一滴（以刚好将菌膜覆盖为宜），染色12min后倾去染液，水洗至流出水无色；2）媒染：先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min，倾去碘液，水洗至流出水无色。3）脱色：用滤纸吸去玻片上的残水（从边缘吸，以防擦去菌体），将玻片倾斜，并衬以白背景，用95%乙醇滴洗至刚刚无紫色为止，约2030秒，立即用水冲去乙醇；,【方法步骤】,4）复染：将玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色2min，
5、水洗，吸去残水晾干（图4-1）。3.镜检：干燥后，油镜观察。以分散开的细菌颜色为准，革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。4.混合制片观察：一载玻片上两种菌混合制片，对比观察。菌龄和脱色程度对染色结果影响较大。,【方法步骤】,A.初染B.水洗C.媒染D.水洗E.脱色F.水洗G.复染H.水洗I.吸干图4-1 革兰氏染色程序,【方法步骤】,获得本实验成功的关键：1）选用活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性。2）涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。3）脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性。,【实验结果】,图4-2 大肠杆菌染色结果
6、图4-3 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合染色结果,【注意事项】,涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热（以玻片不烫手为宜）。加热时使用载玻片夹子及试管夹，以免烫伤。使用染料时注意避免沾到衣物上。使用乙醇脱色时勿靠近火焰。实验后洗手。,【实验报告】,1.结果1）绘出油镜下观察的混合区菌体图像。2）填表,表4-1 结果记录表,2.思考题1）革兰氏染色是否成功，有哪些问题需要注意，为什么？2）现有一株未知杆菌，个体明显大于大肠杆菌，请你鉴定该菌是革兰氏阳性还是革兰氏阴性，如何确定你染色结果的正确性？3）为什么用老龄菌进行革兰氏染色会造成假阴性？4）你认为革兰氏染色法中哪个步骤可以省略？在何种情况下可以省略？,【实验报告】,Central laboratory of Biology,生物学实验教学中心,Thanks for your attention!,
