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1、实验6 微生物的计数、大小的测定和酵母菌的死活鉴别,实 验 目 的,学习并掌握利用显微镜直接计数的基本方法。了解并掌握酵母菌的死活鉴别染色的原理和技术。了解测微尺的构造和使用，学习并掌握测定微生物细胞大小的方法。,实 验 原 理,1.两种常用计数方法，即直接计数法（血球计数板计数法）和间接计数法（平板菌落计数法）。本实验是利用血球计数板进行直接计数。2.利用血球计数板，在显微镜下进行计数，换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。3.美兰（氧化型呈蓝色，还原型呈无色），活的酵母菌染色后是透明的，而死的酵母菌则被染成了蓝色。,血球计数板的构造,9个
2、大格,16小格,25中格,25小格,16中格,无论哪一种都是400个小格,计数室,血球计数板的分区与分格,例一 1大格=16中格=16X25小格=400小格数25x4=100小格,例二 1大格=25中格=25X16小格=400小格数16x5=80小格,血球计数板的构造,每个大方格面积为1mm2，高度为0.1mm，所以每个计数室的体积为 0.1x1=0.1mm3每个小格的体积0.1/400=1/4000mm3=1/4000,000ml,计数方法：通常数五个（或四个）中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成lml菌液中的总菌数。设被选作
3、计数的中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B：如果是25个中方格的计数板，则1mL菌液中的总菌数=A/525104B=50000AB（个）如果是16个中方格的计数板，则1mL菌液中的总菌数=A/416104B=40000AB（个）,微生物细胞大小的测量是在显微镜下用目镜测微尺来进行的，但由于测量的是放大后的图像，故目镜测微尺在不同放大倍率下每格实际代表的长度也随之变化，因此，需用物镜测微尺来校正在不同放大倍率下目镜测微尺每格所代表的实际长度。物镜测微尺是中央刻有精确刻度的载玻片，一般是将1 mm等分为100格，每格长0.01mm，即10 um，它不直接用于测量细胞大小，而是用于校正目镜测微尺的
4、每格的相对长度。目镜测微尺每格长度(um),实 验 材 料,1%酵母菌悬液（市售的干酵母粉）血球计数板、盖玻片、吸水纸显微镜、接种环、分类计数器 0.1%的美蓝染色液 目镜测微尺，物镜测微尺、显微镜、载玻片、盖玻片、吸水纸、0.1%的美蓝染色液,实 验 步骤,1 制备菌悬液、染色 用吸管吸取菌悬液（1滴）加入试管，用生理盐水（8滴）进行稀释，滴加（1滴）美兰染色液。（自己进一步稀释100倍）2 加菌悬液样品 将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用毛细滴管将摇匀的菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，用吸水纸吸去多余水液（注意一定不要有溢出和产生气泡）。,3 显微
5、镜计数 加样后静止1 min，先用低倍镜然后换成高倍镜，计数时，对位于线上酵母菌，一般只数上方和左边线上的，当酵母菌芽体达到母细胞大小的二分之一时，可记作两个细胞。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。,实 验 步骤,微生物名称 总菌数 个/ml,4 清洗血球计数板 计数完毕，将计数板在水龙头下冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用电吹风吹干。5.计算：利用相应公式进行计算（见前面公式或者课本公式），并将实验结果填入作业中的表格内。,微生物大小测量实 验 步骤,（）装目镜测微尺（二）校正目镜测微尺 1.将物镜测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上 2.先用低倍镜观察，将目镜
6、测微尺刻度与物镜测微尺的刻度平行。使两尺的第一条刻度线相重合，再寻找两尺的另一条重合的刻度线，分别记录两重合线之间物镜测微尺和目镜测微尺所占的格数，由公式计算出目镜测微尺每格所代表的长度。3.用同样的方法换成高倍镜进行校正，记录并计算在每种倍率下目镜测微尺每一格所代表的长度。,实 验 步骤,（三）酵母细胞大小的测定 1 制备菌悬液、染色：用吸管吸取菌悬液（1滴）加入试管，用生理盐水（8滴）进行稀释，滴加（1滴）美兰染色液。2 制片：用吸管吸取1滴上述菌悬液滴加到干净的载玻片上，盖上盖玻片（注意一定不要有溢出和产生气泡），将多余菌液用吸水纸吸干。3 显微镜下观察、测量：在不同倍率下测量菌体的长度
7、和宽度，记录测定值，并计算出酵母的长、宽值。,实验注意事项,1.要正确使用显微镜，光线亮度要调的合适。2.菌液稀释倍数要合适。用前摇匀，如果浓度过大就再稀释，如果过小再重做。3.计上不计下，计左不计右。出芽计一半4.浓度稀释标准：以每小方格内含有5-10个酵母细胞为宜，一般稀释10倍即可。5.计数室内一定不要有溢出和产生气泡。6.其他微生物孢子技术与酵母菌类似，基本操作一样。7.确保血球计数板清洗干净。可以加点酒精清洗。,使用血球计数板计数时，应注意什么？将计数结果填入表格中。简单说明酵母菌死活染色的原理。,结果与思考题,结果与思考题,填写实验表一和实验表二，完成酵母菌孢子的大小测定。,表一 目镜测微尺校正结果,表二 酵母细胞大小测定结果,为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正。,
