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1、血清球蛋白的分离纯化与鉴定,刘晓如,【实验目的】1学习盐析法、凝胶层析和离子交换层析分离纯 化蛋白质的基本原理及应用2掌握醋酸纤维薄膜电泳技术的原理及应用3了解蛋白质分离纯化的总体思路,【实验方法】一、盐析法粗分-球蛋白 二、凝胶过滤方法脱盐 三、离子交换层析方法纯化-球蛋白 四、醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定-球蛋白的纯度,【基本原理】蛋白质的分离、纯化及鉴定是研究蛋白质化学性质及生物学功能的重要手段之一。不同蛋白质的分子量、溶解度及在一定条件下，带电的情况等都有所不同。利用这些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质。,分离蛋白质的方法,在分离纯化时，根据情况选用几种方法，相互配合才能达到分离纯化一种蛋
2、白质的目的。,【基本原理】本实验采用硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶过滤、离子交换层析方法，分离纯化血清-球蛋白。最后用醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定-球蛋白的纯度。,实验思路,分段盐析去除杂蛋白,凝胶层析脱盐,交联葡聚糖吸水浓缩,醋酸纤维素薄膜电泳鉴定,先粗后细,离子交换层析纯化,一、盐析法粗分离血清-球蛋白,盐析法是根据不同蛋白质在不同浓度的中性盐溶液中溶解度不同，分别析出，达到彼此分离的方法。本实验在半饱和硫酸铵溶液中，清蛋白溶解，球蛋白将沉淀析出，经离心所得的沉淀即为球蛋白的粗提液。,定义：加入大量中性盐以破坏蛋白质的稳定因素并使从溶液中沉淀析出的现象。原理:破坏蛋白质两个稳定因素：水化膜和电荷层中性
3、盐：(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等。优点：蛋白质不变性，常用。,盐析法,盐析步骤,取离心管一支加入血清 2ml,加入2ml 0.9%氯化钠摇匀,边搅拌混匀边缓慢滴加饱和(NH4)2SO4 4ml,上清液（主要含清蛋白）倾去,静置10min，再离心（5000转/分）10min,沉淀用1ml 0.9%氯化钠搅拌溶解,逐滴加饱和(NH4)2SO4 2ml,摇匀,静置10min，再离心（5000转/分）10min,倾弃上清液（主要含、球蛋白）,沉淀即为初步纯化的球蛋白,加入0.0175mol/L磷酸缓冲液（pH=6.3)1ml溶解,球蛋白粗提液,二、葡聚糖凝胶柱层析脱盐,欲去除盐析法分离
4、得到的球蛋白粗提液中大量盐，通常有两种方法：凝胶层析法、透析本试验采用葡聚糖凝胶Sephadex G 25层析方法除去球蛋白粗提液中的盐硫酸铵，以便下一步用离子交换层析方法进一步提纯球蛋白。,凝胶层析原理：P31,凝胶层析法是按混合物各组分分子量大小不同随流动相经过层析柱的时间不同而被分离的技术。,凝胶是一类具有三维多孔网状结构的干燥颗粒，当吸收一定量溶液后溶涨成柔软、富有弹性、不带电荷、不与溶质相互作用的惰性物质，凝胶层析以其为固定相。层析时，直径大于凝胶网孔的大分子物质不能进入凝胶内部，只能沿着凝胶颗粒间的间隙随流动相向下移动，所以流程短、流速快，首先流出层析柱；而小分子物质直径小于凝胶网
5、孔能自由出入，洗脱时间长，后流出层析柱，经过一定时间层析，分子大小不同的物质彼此分开，达到分离的目的。,凝胶层析法脱盐,凝胶柱层析脱盐,分子筛层析,数学模型,Vo Vi Vt,Vi凝胶孔内水（内水）Vo颗粒间水（外水）Vg凝胶体积总体积Vt=Vi+Vo+Vg,Kd 分配系数：精确衡量混合物中某一待分离成分在凝胶柱内的洗脱行为，反映物质分子进入凝胶颗粒的程度，是溶质分子大小的一个函数Ve洗脱体积：分离物被洗脱时所用的洗脱液体积 Kd=(Ve-Vo)/Vi 洗脱曲线：以洗脱体积为横坐标，各物质浓度/吸光度为纵坐标作图,（1）完全被排阻的极端大分子，Ve=Vo，Kd=0（2）中等分子，Ve=Vo+K
6、dVi，0Kd1（3）完全渗透的小分子，Ve=Vo+Vi，Kd=1,Sephadex G-25的准备 装柱（1520cm）,操作步骤：,1、层析柱保持垂直。2、放蒸馏水，排出空气，关闭出口。3、加入搅拌均匀的SephadexG-25悬液，调节流速10滴/min，使凝胶均匀沉降，不断补充，直至18cm。4、上留1-2mm的水，关闭出口。注意：床面上要保持少许水，防止胶床露出液面。胶面不平，用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉降，使表面平整。,加样与洗脱,凝胶的再生,1、加样：用滴管将盐析后样品加入柱床面，打开出口使样品 溶液渗入凝胶。2、洗脱：加入洗脱液，打开出口，保持流速10滴/min，收 集洗脱液，
7、每管收集1ml。用奈氏试剂检测NH4+。3、保存：20%璜基水杨酸溶液检测洗脱液的蛋白质，保存 含量高的进一步纯化,不断加洗脱液，使NH4+全部流出，为下次实验做准备,脱盐,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10,上样球蛋白，粗提液,装柱 葡聚糖凝胶G-25，柱高18-20cm,流速：每分钟10滴左右,加入洗脱剂,收集 20滴换一支试管,.层析后洗脱液检测,白色比色板,洗净备用。一块在各孔滴加奈氏试剂（检测NH4+）,另一块滴加20%璜基水杨酸（检测蛋白质）。不用滴管,避免污染,直接倒用“-”表示无现象，用“+”,“+”,“+”等表示颜色深浅,回收凝胶,注意事项：1.凝胶柱的制备质量决定分离
8、效果的好坏。2.加样分离时，滴速越慢，分离效果越好。,以管号为横轴，蛋白质含量为纵轴绘制洗脱曲线，分析实验结果。,三、DEAE纤维素离子交换层析,【实验目的】1.通过使用DEAE纤维素离子交换层析法，进一步 纯化-球蛋白脱盐液，得到较纯的-球蛋白溶液 2.学习了解离子交换层析方法的基本原理和应用,离子交换层析的基本原理,离子交换层析是一种常用的、通过使用各种类型的离子交换剂达到分离纯化目的的层析方法。离子交换剂是通过化学反应将带电基团引入到惰性支持物上形成的固体物质，在实验中作为固定相。如果其带负电，则能结合阳离子，成为阳离子交换剂；如果其带正电，则能结合阴离子，称为阴离子交换剂。可根据实验需
9、要，选择不同的离子交换剂进行离子交换层析。DEAE（二乙基氨基乙基）纤维素含有可离子化的碱基，可与氢离子结合，成为带正电荷的阴离子交换剂。,DEAE纤维素离子交换层析纯化球蛋白,血清、球蛋白、清蛋白的等电点为：清蛋白pI=4.64，2球蛋白 pI=5.06，球蛋白pI=5.12，球蛋白pI=7.3 本实验采用0.0175 mol/l pH6.5 NH4Ac缓冲液进行洗脱。此pH，DEAE带正电荷，可与带负电荷的、-球蛋白和清蛋白结合，而带正电荷的-球蛋白不与DEAE结合，首先从层析柱中洗脱出来，首先收集到的既是纯化的-球蛋白。,操 作,将脱盐后的球蛋白加于DEAE柱上（方法同凝胶过滤），用0.
10、0175 mol/l pH 6.3 NH4Ac缓冲液洗脱，流速10滴15滴/分，用小试管连续收集流出液（约1.0 ml/管），用20%磺基水杨酸溶液检查蛋白质分布情况，收集含量最高的部分，浓缩作纯度鉴定。用该缓冲液洗脱下来的是球蛋白。,.使用离心机的操作注意事项。.装柱时检查是否漏水。.装柱后凝胶均一无断层，无气泡，柱床面平整。.柱床面保持有缓冲液。.加样时动作缓慢轻柔，不要破坏柱床面的平整。.每用一次滴管，请用水清洗干净，防止试剂及被测样品交叉污染。,四、球蛋白纯化液的浓缩,利用葡聚糖凝胶富含羟基，吸水，不允许大分子蛋白进入微孔的特性，在样品溶液中加少量凝胶，离心，浓缩蛋白。每ml纯化球蛋白
11、溶液加Sephadex G-25 0.25 g，摇动23分钟，离心3000r/min，5分钟，上清即为浓缩-球蛋白（或用冷冻干燥仪使其浓缩）。,五、球蛋白鉴定,用醋酸纤维素薄膜电泳的方法，以血清电泳图谱为对照，鉴定所分离的蛋白质种类和纯度（参见血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳）。,蛋白质的电离示意图,基本原理,1、以醋酸纤维薄膜作为支持体的一种电泳方法。2、在pH8.6巴比妥缓冲液中，血清蛋白质在电场中均带负电荷，向正极移动。3、带电荷多、分子量相对小的泳动速度快；带电荷少、分子量相对大的泳动速度慢。,血清蛋白质乙酸纤维素薄膜电泳,醋酸纤维素薄膜电泳鉴定,点样：全血清：点样一次 脱盐后的粗蛋白溶液
12、：点样35次 浓缩后的纯球蛋白溶液：点样35次,醋酸纤维素薄膜电泳,电泳条件：电压：90110 V；时间：50分钟。染 色：电泳毕，关电源。取出薄膜浸入盛有氨基黑10B染色液的染色缸中染色5分钟，用2.5%醋酸洗脱液漂洗，直至背景呈白色。以血清蛋白图谱为对照，观察提纯物属哪种蛋白，其纯度如何？,操作步骤：,1、装置电泳箱。区分电泳箱正负极。2、点样：浸于巴比妥溶液中的薄膜，滤纸轻轻吸 干 半干燥态。铅笔标记；点样器沾适量新鲜血清，垂直点样。3、放入电泳槽，使膜保持水平。4、通电：110伏，1小时。断电后，取膜。5、染色：氨基黑10B染色5min。6、漂洗：漂洗液浸洗3次，每次5-10min。,快,+,铅笔标记，垂直点样,保持膜不下垂,半干燥态,按泳动快慢顺序分为：清蛋白、1、2、球蛋白。,注意事项：1、区分电泳槽正负极。2、点样处放在负极端，保持膜水平。3、点样面朝下，以防样品蒸发。,
