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1、实验二 双缩脲法测蛋白质含量,一、分光光度技术的基本原理,光属于电磁波，具有二重性，即不连续的微粒性和连续的波动性。自然界中存在各种不同波长的电磁波，分光光度法所使用的光谱范围在200nm10m之间。其中200400nm为紫外光区，400760nm为可见光区，76010000nm为红外光区。可见光因波长不同而呈现不同的颜色，这些不同颜色的电磁波称为单色光，单色光并非单一波长的光，而是一定波长范围内的光，太阳及钨丝灯发出的白光，是各种单色光的混合光（复合光）。利用棱镜可将白光分成按波长顺序排列的各种单色光，即红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等。,（一）光的基本知识,一切物质都会对某些波长具有吸收的性质
2、，而物质对不同波长的射线，表现为不同的吸收现象，这一性质称为选择性吸收。有色溶液之所以呈现不同颜色，就是由于这种对光的选择性吸收所致。物质的吸收光谱与它们本身的分子结构有关，不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同，因此每种物质都具有其特异的吸收光谱，在一定条件下，其吸收程度与该物质浓度成正比，故可利用各种物质的不同的吸收光谱特征及其强度对不同物质进行定性和定量的分析。分光光度技术，主要是利用物质特有的吸收光谱来鉴定物质性质及含量的技术，其理论依据是Lambert和Beer定律。,（二）吸光度与透光率,当一束平行单色光照射到任何均匀、透明的溶液时，光的一部分被吸收，一部分被容
3、器的表面反射，一部分透过溶液。I0=Ia+It+Ir 在吸收光谱法分析中，测量时采用同样质料的比色皿，反射光强度基本不变，影响互相抵消，于是上式可简化为：I0=Ia+It,透光率：透过光的强度It与入射光的强度Io。之比称为透光度或透光率，用T表示 T=It/Io吸光度(A):A=-lgT=-lg(It/Io)溶液的透光率越大，说明对光的吸收越少；反之，透光率越小，说明对光的吸收越多；T值越小，A值越大。,(三)朗伯-比尔（LambertBeer）定律,朗伯定律:AK1L若溶液浓度不变,一束单色光通过溶液后，则溶液的厚度(L)愈大，光的强度减低也愈显著。即吸光度与溶液液层的厚度成正比。K1为吸
4、光系数，其值取决于入射光的波长，溶液的性质、浓度及温度等。比尔定律:A=K2C若溶液液层的厚度不变,一束单色光通过溶液后，溶液的浓度愈大，则透射光的强度愈弱，即吸光度与溶液的浓度成正比。C为有色物质溶液的浓度；K2为吸光系数。,朗伯-比尔定律:A=KLC 即吸光度与溶液的浓度和液层的厚度的乘积成正比。朗伯-比尔定律是比色分析的基本原理，此定律是描述溶液对单色光的吸收程度与溶液的浓度及液层厚度间的定量关系。是吸收光谱法的基本定律。,二、分光光度计的结构,能从含有各种波长的混合光中将每一单色光分离出来，并测量其强度的仪器称为分光光度计。分光光度计因使用的波长范围不同而分为紫外光区、可见光区、红外光
5、区以及万用(全波段)光光度计等。无论哪一类分光光度计都由下列五部分组成，即光源、单色器、狭缝、样品池，检测系统。,光源:常用的光源有钨灯和氢灯（或氘灯），前者适用于340900nm范围的光源，后者适宜于200360nm的紫外光区。单色器:是将混合光波分解为单一波长光的装置，多用棱镜或光栅作为色散元件。狭缝：是由一对隔板在光通路上形成的缝隙，通过调节缝隙的大小调节入射光的强度，并使入射光形成平行光线，以适应检测器的需要。比色杯：也叫样品池，用来盛测定溶液，各个杯子壁厚度等规格应尽可能完全相等，否则将产生测定误差。可见光区用玻璃比色杯，紫外光区用石英比色杯。检测系统：,1.直接比较法(标准管法)：
6、将标准品与样品分别在相同条件下显色，测定其吸光度，因是相同物质在相同条件下测定，故可按下式计算样品的浓度。C样=A样/A标C标。2.标准曲线(工作曲线)法：用已知浓度的标准溶液，配制成一系列不同（梯度）浓度的标准溶液，在最大吸收波长（max）处测得各个吸光度（A值），以A为纵坐标，浓度为横坐标，作标准曲线，取其直线部分作定量依据。在测定被测样品时，以相同条件在max处测定A值再从标准曲线上查得该样品的相应浓度。,三、分光光度技术的应用,定量分析,1)标准曲线制作与样品管的测定，应在同一仪器上进行。2)理想的标准曲线应该：是一条斜率接近于1且通过原点的直线。3)至少应有五个点，每个点有两个以上的
7、重复值，重复值之间的平均误差应低于5。4)绘制好的标准曲线仅供在同样条件下处理的被测溶液使用。因为测定值与标准曲线之间会因仪器性能、试剂的批号及温度、时间等不同而有所变化。5)标准曲线要经常检查校正。其方法是配制的已知浓度的标准液，按原标准曲线的处理显色，测得吸光度值，然后比较由标准曲线查出的浓度与已知浓度差值，若差值在实验要求的允许范围内，标准曲线仍可使用，超出则需要重新绘制。为校正的方便，标准曲线绘制完毕后，应在坐标纸上注明测定内容，仪器型号和波长，绘制日期等。,绘制标准曲线注意事项,分光光度计必须放置在固定而且不受振动的仪器台上，不能随意搬动，严防振动，潮湿和强光直射。比色杯盛液量以达到
8、杯容积23左右为宜。若不慎将溶液流到比色杯的外表面，则必须先用滤纸吸干，再用擦镜纸或绸布擦净，然后才能把比色杯放入比色杯槽内。移动比色杯槽要轻，以防溶液溅出，腐蚀机件。不可用手拿比色杯的光学面，禁止用毛刷等物摩擦比色杯的光滑面。用完比色杯后应立即用自来水冲洗，再用蒸馏水洗净。若用上法洗不净时，可用5的中性皂溶液或洗衣粉稀释浸泡，也可用新配制的重铬酸钾-硫酸洗液短时间浸泡，之后立即用水冲洗干净。洗涤后应把比色杯倒置凉干或用滤纸条将水吸去，再用擦镜纸轻轻揩干。,使用分光光度计时的注意事项,一般应把溶液浓度尽量控制在吸光度值0.10.7的范围内进行测定。这样所测得的读数误差较小。如吸光度不在此范围内
9、，可调节比色液浓度，适当稀释或加浓，使其在仪器准确度较高的范围内进行测定。仪器连续使用时间不应超过2h，每次使用后需要间歇半小时以上才能再用。每套分光光度计上的比色杯及比色杯槽不得随意更换。分光光度计内放有硅胶干燥袋，需定期更换。,实验二双缩脲法测定蛋白质含量,实验目的 1.掌握分光光度计的使用方法。2.掌握标准管法测物质含量的方法。3.掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法。,实验原理 双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物，在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色络合物，此反应即为双缩脲反应。含有两个或两个以上肽键的化合物都具有双缩脲反应。蛋白质含有多个肽键，在碱性溶液中能与Cu络合成紫红色化合物。其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，可以用比色法进行测定。双缩脲法最常用于需要快速但并不需要十分精确的测定。,实验操作,1.取三支试管按下表操作,2、摇匀，37水浴20min后用分光光度计于540nm波长处比色，以空白管调零点，测得各管吸光度。3、计算：血清总蛋白质(g100ml）A测/A标0.005100/0.1,
