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1、实验五 重组DNA技术,不同来源的DNA分子通过磷酸二酯键连接成新的DNA分子，这一过程称为DNA重组。基因重组是自然界的一种常见现象，是物种演变、生物进化的基础。,不同来源的DNA分子,重组DNA分子,基因重组,在分子水平上,根据人们的需要以人工的方法取得感兴趣的目的基因,在体外与载体DNA分子重组,然后将重组分子转入受体细胞,并筛选出能表达重组DNA的活细胞,加以纯化、扩增，成为克隆。,重组DNA技术,克隆：来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。如细菌克隆、动物克隆和分子（DNA）克隆等。,Restriction enzymes:,选（分）切接转筛扩,重组DNA技术的基本过程,其作用是：携带
2、目的基因DNA（或外源DNA)进入宿主细胞（大肠杆菌，哺乳动物细胞等）。使外源DNA在宿主细胞复制扩增或表达。,载体的选择,常用载体：质粒DNA，噬菌体DNA，病毒DNA,1能在宿主细胞中独立复制，并能携带重组DNA片段一同扩增；2有合适的限制性酶切位点便于进行克隆；3载体分子应尽量小，可插入较大的外源DNA而不影响复制；4有一定的筛选标记，易于识别和筛选；5表达型载体应配备与宿主细胞相适应的启动子、前导序列、增强子等调控元件；6生物安全性好。,载体的选择标准,insert,BamHI,replication,存在于细菌染色体外的小的共价、闭环双链DNA分子。,（1）,本实验应用的质粒,质粒D
3、NA的提取和鉴定,碱裂解法抽提质粒DNA:利用基因组DNA和质粒DNA变性和复性的差异来分离提取质粒。在pH高达12.6的条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但它的超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型。而染色体DNA不易复性而形成缠连的网状结构。进一步用氯仿使蛋白质变性去除蛋白杂质，用无水乙醇沉淀质粒DNA，可得到纯化的质粒DNA。,将菌液倒入1.5ml离心管中(尽量倒满)12000rpm/30s(沉淀菌体)在原管中重复上述操作1次 弃上清扣干,加入预冷的
4、solution 100L,剧烈振荡打散菌体,冰浴5min（以下操作要轻柔）加入新配制的solution 200L,温和颠倒离心管23次混匀，室温放置5min（此时液体应由混浊变为透明粘稠）加入预冷的solution 150L,温和颠倒离心管23次混匀，冰浴5min 离心12000rpm/5min 小心将含有质粒DNA的上清移至另一离心管中 加等体积氯仿,轻微振荡，离心12000rpm/2min 转移上清液至另一离心管 加入2倍体积冰冷无水乙醇,轻轻混匀室温放置2分钟 离心12000rpm/5min 弃上清,加入70%乙醇洗涤沉淀，离心12000rpm/2min，弃上清 重复洗涤1次弃上清，液
5、体尽量倒净并在吸水纸上扣干 室温放置15min干燥 加入1TE 30L 溶解质粒,用于定量分析、电泳检测等。,Solution I 中的EDTA可以螯合二价金属离子进而抑制依赖于二价金属离子的DNA酶的活性，对DNA起到保护作用。加入solution后一定要充分打散菌体。Solution II要新鲜配置,NaOH可吸收空气中的二氧化碳而减弱碱性。加入solution II后放置时间不要超过5min，以免变性质粒不易复性。加入solution II后液体应由混浊变为透明粘稠，可见拉丝现象。若没有上述现象发生，则实验不能继续下去，应检查试剂配制及操作是否有误，然后重新开始。质粒DNA提取过程中动作
6、要轻柔，以免对DNA造成损伤。,为什么用无水乙醇沉淀DNA？,这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67左右。,琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA,DNA的电泳原理与蛋白质电泳基本相同。在pH高于其pI时，DNA分子带负电荷，在直流电场中DNA向正极泳动。不同的DNA分子因所带电荷、构象和分子量大小不同，在同一电泳系统中的泳动速度存
7、在差异，因而可以使核酸片段彼此分离，并检测其分子大小。电泳后的凝胶浸泡于荧光染料（如溴化乙锭）中，染料分子可嵌入DNA分子碱基之间，在紫外线照射下发出荧光，可观察到核酸片段所在的位置和亮度，从而对DNA进行定性或定量测定。,琼脂糖凝胶分离范围 琼脂糖浓度%线状DNA分子分离范围Kb 0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2,琼脂糖凝胶的浓度可根据DNA分子的大小来确定，一般基因组DNA可用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳检测，质粒DNA选择1琼脂糖凝胶，而对只有几百个碱基对的寡核苷酸可制备浓度更高一些的琼
8、脂糖凝胶。,1凝胶板的制备2灌胶3待胶凝固完全后，将铺胶的有机玻璃胶槽放在电泳槽中，加入0.5TBE电泳缓冲液，液面高于凝胶面约0.5cm，轻轻拔出梳子。4加样：将质粒DNA作为上样样品。将样品10L和上样缓冲液6：1混匀，用微量加样器将样品分别加入胶板的样品小槽内（注意：加样时应防止加样器头碰坏凝胶孔壁）。5电泳：靠近样品槽一端连接负极，另一端连接正极，接通电源，开始电泳，控制电压在80-100V左右。当染料条带移动到距离凝胶前沿1cm时，停止电泳。6染色：将电泳后的胶板小心推进含溴化乙锭（0.5g/mL）的染色液中，室温下浸泡约30min。7观察：小心取出凝胶并用水轻轻冲洗胶表面的溴化乙锭溶液，将凝胶放在紫外灯观察台上，在波长254nm紫外灯下进行观察。8结果分析：在DNA存在的位置呈现橘红色荧光，肉眼可观察到清晰的条带。质粒DNA由于不同构型的DNA在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率不同，因此在琼脂糖凝胶电泳可出现三条电泳带，分别为三种构型的质粒DNA，超螺旋DNA最快,线状DNA次之,开环DNA最慢。,上样缓冲液（6）：,指示剂（溴酚蓝和二甲苯青）一般加在电泳上样缓冲液中，可使样品带色，便于上样、估计电泳时间和判断电泳位置。蔗糖：增加样品密度，使样品均匀沉到加样孔底部。,
