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1、实验基本技术,细胞培养基本技术,无菌操作技术,消毒(disinfection)和消毒剂(disinfectant)灭菌(sterilization)防腐(antisepsis)和防腐剂抑菌(bacteriostasis)和抑菌剂(bacteriostatic)无菌(asepsis)无菌技术/无菌操作(antiseptic technique),【培养前准备】在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。【操作野消毒】无菌
2、培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面次(拖布要专用)，紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。,【洗手和着装】原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可穿着细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75酒精消毒手。如果实验过程中
3、手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。【火焰消毒】在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。【操作】进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。,培养细胞的观察,肉眼观察培养物颜色及混浊度倒置显微镜观察细胞生长状态,细胞计数,1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。3、静置
4、3分钟。4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：细胞数/ml4大格细胞总数/410000注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。,根据细胞生长的恃点，传代方法有3种：1悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l2一23，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。
5、3贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。,细胞传代方法,贴壁生长细胞传代方法,1 吸光培养瓶中的培养液2 加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-10 min（显微镜下动态监测）。3 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。4 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。5 离心，细胞沉淀用培养液制成悬液。5 吸取1/101/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。6 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。7 将后者放入培养箱中培养。,任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。在细胞群体中
6、总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。,培养细胞活力测定,1台盼蓝法活细胞不被染色，死细胞染成蓝色；用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力；方法：1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中；2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟；3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片；4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力；死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。活力测定可以和细胞计数合起来进
7、行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。,2四唑盐（MTT）比色法四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝；MTT比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值；MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。,操作步骤：（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37、5CO2培养箱中培养一段时间
8、（根据实验目的决定培养时间）；（2）加入2毫克毫升的MTT液（50微升孔）；继续培养3小时；（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解；（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570纳米）。记录结果，绘制细胞生长曲线。,细胞冻存和复苏,细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。,冻存和复苏的原则：慢冻快融,当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反
9、，结晶很大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。,慢冻程序,标准程序：当温度在-25以上时，12/min 当温度达-25以下时，510/min 当温度达-100时，可迅速放入液氮中简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降12的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投入液氮中。,低温保护剂的应用,在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过
10、程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。,细胞冻存方法,1预先配制冻存液：含20%血清培养基，10%DMSO，DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞；2取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1106 5 106细胞/ml)；3加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。,细胞复苏方法,（1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738 水浴中，使其融化（1分钟左右）；（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上；（3）低速离心10分钟；（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。,免
11、疫组化基本技术,1、标本的取材2、组织的固定 3、脱水、透明和包埋4、切片,一、组织与细胞材料的制备,手术切除标本，各种活检穿刺标本、尸体解剖标本和动物组织标本。原则上，应尽快取材，但比较大的手术标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定后取材。细胞大量培养后，经消化将细胞制成悬液（106）涂在涂有切片粘合剂的载玻片上，凉干后固定。,1、标本的取材,防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。常用固定液有：甲醛、4多聚甲醛、Bouin S液等。固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度
12、，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。组织固定后必须彻底冲洗。,2、组织标本的固定,脱水：75、85乙醇，95、乙醇，无水乙醇、。透明：二甲苯、二甲苯、二甲苯浸蜡：石蜡、石蜡、石蜡石蜡包埋：修蜡块，标号,3、组织脱水、浸蜡及包埋,切片可分石蜡切片、冰冻切片、火棉胶切片，IHC切片要求不同与常规切片，需连续有序，防止脱片等特殊要求。,4、组织切片,1、石蜡切片的脱蜡至水2、内源性酶的消除方法3、热诱导的抗原修复 4、显示系统的选择和配制 5、衬染剂的选择和配制,二、IHC的一些基本技术,冰冻切片从-80取出，凉干或电吹风吹干后可直接进行免疫组化标记
13、。石蜡切片需经如下脱蜡才能做IHC。二甲苯10min，二甲苯10min，二甲苯10min，无水乙醇2min，95乙醇2min，85乙醇2min，75乙醇2min，流水冲洗。,1、石蜡切片脱蜡至水,1.内源性过氧化物酶的消除方法：0.3%3%H2O2甲醇液20min；1 H2O2 20min；3苯肼溶液371h；0.075%盐酸甲醇液 30min等。2.内源性碱性磷酸酶的消除方法：10醋酸 10min；0.5mol/L碳酸氢钠（pH9.0）20min；1mol/L左旋咪唑 20min。3.内源性生物素的消除方法：2-甲基-D苷露糖饱和生物素；先用25g/ml卵白素孵育15min，PBS洗10mi
14、n，移至生物素饱和液中处理15min，PBS洗15min。,2、内源性酶的消除方法,1.抗原修复(Antigen Retrieval;AR)是以高温、高压对常规固定的石蜡切片进行抗原修复或复原的一种非蛋白酶消化以提高抗原抗体阳性检测的一种方法和技术手段。2.修复方式：微波9610min2；直接加温100，15min；水浴锅100，15min；高压锅/消毒锅120，5min；真空加热10min；直接烤片法。,3、热诱导的抗原修复,3.修复介质：0.01M pH6.0柠檬酸缓冲液(CB)；0.05mTris-HCL(pH1-12系列);0.01M pH7.0 PBS;2%硫酸铝；2硝酸铝；生理盐水
15、；蒸馏水。认为修复介质种类和溶液的摩尔浓度对修复效果影响较小，而pH值则影响较大。缓冲液以CB和Tris-HCL较常见。4.温度与修复时间的关系：许多的实验结果表明，温度高修复时间短，呈正相关。例如，Ki-67、P-gp的检测，利用同一切片，达到相同的染色结果如下步骤：100 20min；90 40min；80 60min；70 20h。,3、热诱导的抗原修复,目前用于IHC的标记酶主要有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AKP）。HRP显示系统为：3、3-二氨基联苯胺盐酸盐(3、3-diaminbezidine;DAB)、3-氨基-9-乙基卡吧唑(3-amino-9-ethlylcarb
16、azde;AEC)、四甲基联苯胺、盐酸对苯二胺、4-氯-1-萘酚、高香草酸、萘酚派若宁 HRP显示系统为：BCIP（5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸)NBT(硝基四氮唑蓝)、萘酚AS-BI磷酸盐快红或快蓝。,4、显示系统的选择,5、衬染剂的选择和配制,1.Mayer氏苏木素：取1g Mayer氏苏木素加温溶于100ml蒸馏水中，再加入50g碘酸钠和50g钾明矾，溶解后加入枸橼酸和水合氯醛，溶解后过滤。2.Harris氏苏木素：取2.5g Harris氏苏木素溶于25ml无水乙醇中，另将钾明矾加温溶于500ml蒸馏水中，待钾明矾全部溶解，再将二液混合在一起，加入氧化汞，溶解30min，冷却后过滤，
17、使用时加醋酸4ml，可增加染色强度。,3.甲基绿：取2甲基绿水溶液20ml倾入洁净的分液漏斗，加入三氯甲烷充分摇荡混合，使甲基绿中的甲基紫溶于氯仿中而呈紫红色。旋动分液漏斗下部的砂塞，移去紫红色的三氯甲烷，如此反复更换氯仿，直到氯仿为无色。4.核固红：取0.1g核固红溶于100ml 15硫酸铝水溶液，加热溶解，冷却后过滤。,5、衬染剂的选择和配制,RT-PCR基本技术,Trizol提取RNA原理,Trizol法提取细胞总RNA是目前常用的提取方法。细胞内大部分的RNA与蛋白质结合在一起，以核蛋白形式存在。Trizol内含异硫氰酸胍和苯酚等物质。异硫氢酸胍(GuSCN)是一种强的蛋白质变性剂，不
18、仅能使细胞裂解，同时还能有效地抑制细胞内源性RNA酶的活性。通过有机溶剂的分步抽提，最终可获得纯度较高的细胞总RNA。,RNA提取注意事项,Trizol试剂含有苯酚，具有毒性和刺激性，注意操作。如皮肤接触Trizol，请立即用大量水冲洗。RNase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉，注意随时勤换手套，样品尽可能盖严；尽量不要对着RNA样品呼气或说话。用0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后灭菌，烘干。溶液需用DEPC水配制。细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低最后得率，因为一部分RNA会残留在未裂解的细胞中。在清洗和裂解细胞时最好在低温下操作，防止在操作过程中释放的内源RNase
19、降解了RNA。,逆转录(Reverse Transcription),逆转录指遗传信息从RNA流向DNA，是RNA指导下的DNA合成过程，即以RNA为模板，四种dNTP为原料，合成与RNA互补的DNA单链，称为互补DNA(complementary DNA,cDNA),逆转录原理,cDNA合成有两个关键因素，一是病毒RNA的质量，二是逆转录酶。逆转录酶是一种多功能酶，它能在一定的条件下，以单链RNA为模板合成第一条cDNA链。通过RNaseH活性水解RNA-DNA杂合分子中的RNA链。,逆转录酶,催化逆转录过程的酶称逆转录酶，RNA病毒中都含有此酶。具有三种酶活性：RNA指导的DNA聚合酶 R
20、NA水解酶活性 DNA指导的DNA聚合酶,逆转录体系,RNA模板 3UUAGGCCUGGAUAAGCGCCUGGA 5,引物 5ATCCGGAC,逆转录酶,dATP,dGTP,dCTP,dTTP,Mn2+,酶活性依赖金属离子,底物,逆转录过程中cDNA的合成,逆转录引物的选择,Oligo(dT)(12-18个核苷酸组成），只有mRNA被逆转录随机六聚寡核苷酸，所有RNA均被逆转录基因特异性引物，仅产生需要的DNA,以DNA为模板，利用DNA聚合酶的特性体外扩增特定的基因片断，这种方法被称为DNA聚合酶链式反应。,PCR 基因放大连琐反应,PCR反应,PCR基本原理,利用高温可使DNA变性和低温
21、可使DNA复性的特性，根据体内细胞分裂中DNA半保留复制机理，以特异性寡核苷酸为引物，DNA分子为模板，在DNA聚合酶和四种脱氧核苷酸存在的条件下体外合成新DNA分子的过程。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。,PCR基本成分,templateprimersTaq polymerase10PCR bufferdNTPsMg+,PCR Primers,PCR Primers,序列发现的时间和发现者序列的生物体来源序列的组织来源,引物设计,引物长度（length）:2030bp引物中四种碱基的分布应该是随机的两引物间不能有互补序列，尤其是3端
22、引物的碱基顺序不应与非扩增区域由同源性引物的3末端碱基一定要与模板DNA配对可以在5末端加上限制性内切酶位点或起始密码解链温度(Tm)：两引物间相差不大于5引物内部不能有大于3bp的反向重复序列或自身互补序列存在,PCR基本程序,预变性（Pre-denaturation)变性(Denaturation)退火(Annealing)延伸(Elongation)25-30 cycles,PCR反应,取无菌02ml PCR管一支，加入：10PCR缓冲液 5l氯化镁 4l4种NTP混合液(10mmol/L)05l3端引物(10mol/L)1l5端引物(10mol/L)1lTaq DNA多聚酶(5u/l)
23、025l三蒸水 3325l模板cDNA 5l盖紧盖子，离心数秒后置PCR仪上进行扩增。PCR循环为：95预变性2 min，95变性30 s、55复性30 s、72延伸1 min，30个循环，最后72C延伸7 min。,细胞裂解,RNA释放,cDNA,PCR扩增,逆转录酶,耐热DNA聚合酶,RT-PCR扩增,引物dNTPs二价金属离子DNA聚合酶,引物dNTPs二价金属离子逆转录酶,RT-PCR过程,逆转录酶/耐热DNA聚合酶,琼脂糖凝胶电泳技术,琼脂糖凝胶电泳基本原理,琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖作为固体支持物的一种电泳方法。因为各种核酸分子的电荷及质量之比是相近的，在没有支持物的电场中，它们以相
24、同的速度前进。琼脂糖凝胶电泳具有分子筛效应，所以在适当浓度的琼脂糖凝胶中电泳，线性DNA分子在电场中的迁移率与其分子量的对数成反比，从而达到分离的目的。,琼脂糖凝胶电泳分离的原理,使 TAE浸过凝胶表面在阴极的加样孔加样（红正黑负）分子筛作用分子量越小，迁移速度越快,琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围Separation Range Vs.%Agarose,琼脂糖凝胶浓度与分离效率,大片段在 0.7%琼脂糖凝胶中分离效果好,小片段在 1.5%琼脂糖凝胶中分离效果好,上样,上样缓冲液甘油可增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置使样品呈色，使加样操作更方便EDTA,SDS 可灭活限制性内切酶,溴化乙锭(EB)染色,EB堆砌在DNA双螺旋的碱基对之间,DNA 分子越小,结合的EB 越少,染色越淡,溴化乙锭是一种荧光染料,可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光，常用 0.5mg/ml,+,+,注意事项,一定要等凝胶冷却至60时再入加溴化乙锭切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样 孔的一端为负)加完样品后最好先观察一段时间插电极或拔电极时必须将仪器电源关掉不要使样品跑出凝胶,谢 谢！,
