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1、2023/10/12,紫杉醇前体依赖于MEP途径合成的分子调控机理TcMCT和TcMCS基因的克隆与功能研究,植物学专业硕士研究生 杨颖舫指导教师 廖志华 教授 西南大学生命科学学院,2010年6月4日星期六,2023/10/12,目录,2023/10/12,南方红豆杉的概况,种 名：南方红豆杉 学 名：Taxus chinese 别名：刺柏松，紫杉，紫柏松 科属：红豆杉科、红豆杉属 保护等级：国家级重点保护野生植物（国务院1999年月日批准）产地分布：产于我国长江流域以南，常生于海拔1000-1200m以下山林中，星散分布.,背景概况及目的,2023/10/12,为什么要研究红豆杉,世界卫生
2、组织（WHO）2008年12月9日发布报告称 2010年，癌症将超越心脏病成为全球头号杀手。而吸烟、摄入过多高脂肪食品、人口老龄化以及世界人口持续增长等因素是造成癌症患者与日俱增的原因。WHO预计，在全球范围内，新增癌症病例和癌症患者死亡率也将会以每年1的速度递增，而在中国、俄罗斯和印度这些国家增长速度会更快。报告说：“全球癌症患者在上世纪最后30年里翻了一番，估计这一数字在2020年前将再翻一番，2030年前将增至上世纪最后30年的3倍。”这意味着到2030年，全球将新增2700万癌症病例，死于癌症的人数将达到1700万人。,背景概况及目的,2023/10/12,紫杉醇一种高效的抗癌药物,紫
3、杉醇是红豆杉属植物中的一种四环二萜化合物,也是目前所了解的一种可以促进微管聚合和稳定已聚合微管的药物。紫杉醇是一种有丝分裂抑制剂，使肿瘤细胞停止在G2期和M期，直至死亡，进而起到抗肿瘤作用。紫杉醇还可调节体内的免疫功能，对肿瘤细胞起杀伤或抑制作用。通过-临床研究，紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤有一定疗效。,紫杉醇 分 子 式：C47H51NO14 物理性质：白色结晶体粉末。无臭，无味。不溶于水，易溶于氯仿、丙酮等有机溶剂。,背景概况及目的,2023/10/12,紫杉醇合成研究,传统育种技术培育红豆杉栽培品种,紫杉醇的化学全合成和半合成,分离培养
4、与红豆杉共生的产紫杉醇微生物,利用植物细胞培养技术生产紫杉醇,利用基因工程遗传改良,周期长效率低,步骤长产率低副产物多,含量低菌种易衰退,产量低,（1）红豆杉离体培养和遗传转化的成功，为利用基因工程技术遗传改良红豆杉奠定了良好的实践基础；（2）把植物次生代谢途径中的关键酶基因导入植物或其他物种中高效表达用于生产有用的次生代谢物质有诸多成功报道。,优势,背景概况及目的,2023/10/12,紫杉醇生物合成的上游代谢途径,2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶,2-C-甲基赤藓醇-2，4-环焦磷酸合成酶,背景概况及目的,2023/10/12,紫杉醇生物合成的下游代谢途径,背景概况及目的,2
5、023/10/12,基于RACE技术的同源性克隆方法克隆了南方红豆杉中的两个基因（MCT和MCS）TcMCT和TcMCS基因的功能验证TcMCT基因的原核表达和酶活测定TcMCT基因的组织差异表达,研究内容,2023/10/12,技术路线,2023/10/12,A,B,C,TcMCT基因的获得,研究结果与分析,基因克隆,2023/10/12,TcMCT 全长cDNA序列及编码的氨基酸序列,质体转运肽,全长：1293-bpORF：942-bp5端非编码区：58-bp3端：249-bp编码313个氨基酸分子量约为34.3 kDa等电点：8.96,研究结果与分析,基因克隆,2023/10/12,h表
6、示-螺旋，e表示-片层，t表示-转角，c表示随意卷曲；30.13%的-螺旋、21.15%-片层、8.97%-转角和39.74%随意卷曲构成。,TcMCT蛋白质的二级结构预测,基因克隆,研究结果与分析,2023/10/12,“”表示CTP结合 位点,TcMCT氨基酸序列多重比对,红框表示MEP的结合位点,TcMCT分别与银杏(Ginkgo biloba)的MCT、和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的MCT具有较高的同源性，同源性分别为59.3%、56.9%，相似性分别为69.1%、65.5%。,研究结果与分析,基因克隆,2023/10/12,细菌来源MCT用表示；植物来源用三角
7、表示，其中被子植物用表示，裸子植物用表示。分支上的数字为Bootstrap值(重复1000次)。,TcMCT系统进化树,基因克隆,研究结果与分析,2023/10/12,TcMCT三级结构预测,-螺旋用红色螺旋状表示，-片层用蓝色板状表示，随机卷曲用灰色绳状表示。锌离子结合位点用不同颜色小球标注出,基因克隆,研究结果与分析,TcMCT具有两个高度保守的活性位点 底物MEP结合位点：Arg102-Lys109 底物CTP结合位点：Arg239-Lys295,2023/10/12,TcMCT基因的功能验证,功能验证,利用携带有pAC-BETA质粒的大肠杆菌菌株XL1-Blue来验证TcMCT蛋白的功
8、能，通过转入携带有TcMCT基因的pTrc质粒，TcMCT在大肠杆菌中超表达，与pAC-BETA共同推动代谢流往下游流动，生产黄色的类胡萝卜素。,研究结果与分析,2023/10/12,TcMCT重组蛋白的诱导,Marker 1 2 3 4 5 6 7 8 9,第1泳道为M15诱导前；2.M15空菌，37诱导4 h后；3.pQE30转化到M15菌，诱导前；4.pQE30转化到M15菌，37诱导4 h后；5.TcMCT-pQE30转化到M15菌，诱导前；6.TcMCT-pQE30转化到M15菌，16低温诱导20h；7.TcMCT-pQE30转化到M15菌，37诱导4 h；8.TcMCT-pQE30
9、转化到M15菌，37诱导4 h后上清；9.TcMCT-pQE30转化到M15菌，37诱导4 h后沉淀,蛋白表达,97KD66KD55KD42KD31KD21KD14KD,研究结果与分析,2023/10/12,过Ni-NTA亲和树脂纯化TcMCT重组蛋白的的SDS-PAGE,Marker 1 2 3 4 5 6 7,第1泳道为结合缓冲液缓冲液(pH7.0)洗柱洗出的杂蛋白；第2泳道10mmol.L-1咪唑洗柱；第3泳道为25mmol.L-1咪唑结合缓冲液洗柱，洗脱下来的TcMCT重组蛋白；第4-7泳道是用50，70，90，100mmol.L-1咪唑梯度结合缓冲液洗柱洗柱，彻底洗脱目的蛋白,蛋白表
10、达,97KD66KD55KD44KD31KD21KD14KD,研究结果与分析,2023/10/12,通过分子筛进一步纯化TcMCT蛋白,蛋白表达,TcMCT重组蛋白通过superdex-200凝胶柱的洗脱曲线,通过分子筛收集61-67管TcMCT重组蛋白的SDS-PAGE,97KD66KD55KD44KD31KD21KD14KD,61 62 63 64 65 66 67 Marker,研究结果与分析,2023/10/12,TcMCT重组蛋白含量测定,蛋白表达,考马斯亮兰法(Bradford法)测定重组蛋白含量,由此标准曲线，根据TcMCT蛋白测出的A595值，即可查出蛋白质含量。得出TcMCT
11、蛋白的含量为0.2mg/ml。,研究结果与分析,2023/10/12,TcMCT重组蛋白的酶活性测定,蛋白表达,采用无机焦磷酸法测定酶活：反应在底物浓度充分，酶量固定的情况下反应体系在0-50min，OD值的变化量，绘制曲线计算出酶的活性为9(U/mg)。,研究结果与分析,2023/10/12,TcMCT重组蛋白在25下的CD图谱,用圆二谱色仪(eireulardichroism,CD)在25下对TcMCT二级结构进行了测定结果为:-helix70.9%，-sheet0%，-turn 0%，random coil 29.1%。TcMCT预测的二级结构包含30.13%的-螺旋、21.15%-折叠
12、片、8.97%-转角和39.74%随意卷曲,蛋白表达,研究结果与分析,2023/10/12,组织差异表达,TcMCT基因的标准曲线图,18S基因的标准曲线图,研究结果与分析,2023/10/12,组织差异表达,TcMCT和18S基因的溶解曲线图,TcMCT和18S基因的扩增曲线图,研究结果与分析,2023/10/12,TcMCT在南方红豆杉中不同组织的表达水平,组织差异表达,研究结果与分析,2023/10/12,D,D,TcMCS基因的获得,基因克隆,研究结果与分析,2023/10/12,TcMCS全长cDNA序列的分析,TcMCS全长为1081-bp，包含一段长度为744bp的ORF及一段长
13、度为16-bp的5-端非编码区和321-bp的3端非编码区编码一个由247个氨基酸残基组成的蛋白质预测的分子量约为26.1kDa等电点(pI)为8.97,基因克隆,研究结果与分析,2023/10/12,TcMCS 全长cDNA序列及编码的氨基酸序列,质体转运肽,基因克隆,研究结果与分析,2023/10/12,TcMCS蛋白质的二级结构预测,h表示-螺旋，e表示片层，t表示-折叠，c表示随意卷曲 TcMCS包含26%的-螺旋、23%-折叠片、7%-转角和44%随意卷构成,基因克隆,研究结果与分析,2023/10/12,“”表示底物结合的活性位点,TcMCS氨基酸序列多重比对,基因克隆,TcMCS
14、分别与Taxus media MCS(93.9%identity)、Cephalotaxus fortunei(73.7%identity)、Ginkgo biloba MCS(61.7%identity)和Arabidopsis thaliana MCS(60.3%identity)具有很高的同源性。,研究结果与分析,2023/10/12,TcMCS系统进化树,裸子植物来源的MCSs用表示，被子植物用表示，细菌用表示，分支上的数字为Bootstrap值(重复1000次)。,基因克隆,研究结果与分析,2023/10/12,TcMCS蛋白质三级结构预测,-螺旋用红色螺旋表示，-片层用黄色板状箭头
15、表示，随机卷曲用绿色绳状表示。活性位点的残基(His79、His208、Asp212、Ser213、Glu216、Arg218、His223）在图上标注,基因克隆,TcMCS 单体结构图,TcMCS行使功能和晶体堆积时均以三聚体形式存在，即三个亚基的-折叠片面对面形成类桶结构，-螺旋包裹在亚基的外围。,研究结果与分析,2023/10/12,TcMCS基因的功能验证,利用携带有pAC-BETA质粒的大肠杆菌菌株XL1-Blue来验证TcMCS蛋白的功能，通过转入携带有TcMCS基因的pTrc质粒，TcMCS在大肠杆菌中超表达，与pAC-BETA共同推动代谢流往下游流动，生产黄色的类胡萝卜素。,T
16、cMCS基因的功能验证,功能验证,研究结果与分析,2023/10/12,结论与展望,（1）首次从南方红豆杉中克隆出紫杉醇前体代谢途径中两个基因MCT 和MCS全长cDNA，对其进行了详尽的生物信息学分析；（2）原核表达TcMCT蛋白，Ni-NTA柱亲和层析获得约35KD的TcMCT重组蛋白。用圆二色谱仪对TcMCT进行二级结构测定，该重组蛋白中含有-helix70.9%，-sheet0%，-turn 0%，random coil 29.1%。重组蛋白能够催化MEP和CDP生成CDP-ME，具有2-C-甲基-D-赤醇-4-磷酸胱氨酰转移酶的活性；（3）颜色互补试验表明TcMCT基因和TcMCS基因的表达可以加速大肠杆菌体内-胡萝卜素的合成；（4）RT-PCR技术对TcMCT进行组织表达谱分析，结果表明TcMCT在皮的表达量最高。,2023/10/12,（5）后续工作：Southern blot分析TcMCT和TcMCS基因在南方红豆杉基因组中拷贝数；HPLC-ELSD测定南方红豆杉各组织中紫杉醇的含量，进一步分析目的基因的表达和紫杉醇生物合成的关系；阐明基因在紫杉醇合成中的作用。,结论与展望,2023/10/12,致谢,感谢导师廖志华教授的悉心指导感谢师兄、师姐、师弟、师妹的帮助和支持感谢在座的各位老师,2023/10/12,Thanks for your attention!,
