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1、第二章 实验室检验,一、血样的采集,(一)末梢采血(二)静脉采血(三)心脏采血,一、血样的采集,根据检验项目及采血量的多少，以及动物的特点，可以选用末稍采血、静脉采血和心脏采血。(一)末梢采血 适用于采血量少，血液不加抗凝剂而且直接在现场检验的项目。如涂血片，血红蛋白测定、血细胞计数等。马、牛可在耳尖部，猪，羊，兔等在耳背边缘小静脉，鸡则在冠或肉髯。,(二)静脉采血 适用于采血量较多，或在现场不便检查的项目。如血沉测定，红细胞压积容量测定及全面的血常规检查等。除制备血清外，静脉血均应置于盛有抗凝剂的容器中，混匀后以备检查。马，牛、羊的采血一般多在颈静脉.猪可在耳静脉或断尾采血，如果小猪在耳静脉
2、采血困难，必要时可在前腔静脉采血。使猪仰卧保定，把两前肢向后方拉直，同时将头向下压，使头颈伸展，充分暴露胸前窝.禽可在内侧的翅静脉.狗，猫及肉食兽可在四肢的静脉采血.,血样的采集,(三)心脏采血 禽和实验小动物需要血量较多时可用本法。如鸡的心脏采血，右侧卧保定，左胸部向上，用l0ml注射器接上5cm长的20号针头，在胸骨脊前端与背部下凹处联线的中点，垂直或稍向前内方刺入23cm，可采得心血，成年鸡每次可抽5一l0ml。兔的心脏采血，在固定板上仰卧保定，局部剪毛消毒，用左手后4个手指按紧兔的右侧胸壁，拇指感触兔左侧胸壁心脏搏动最强处，右手持注射器垂直刺入，边刺边回抽，如刺中右心室可得暗红色的静脉
3、血，刺中左心室则抽出鲜红色的动脉血。成年兔每次可抽血1020m1。,血样的采集,二、血样的抗凝及处理,(一)血样的抗凝 1.双草酸盐合剂2乙二胺四乙酸二钠(简 称EDTA二钠)3柠檬酸钠。4肝素。(二)血样的处理,二、血样的抗凝及处理,(一)血样的抗凝 除需分离血清外，自静脉或心脏采出的血液均应加入抗凝剂，以防血样凝固。临床常用的抗凝剂除肝素(具有抗凝血酶的作用)外，多数是以脱钙作用而使血液不能凝固。常用的抗凝剂有下列几种。1.双草酸盐合剂。草酸铵1.2g，草酸钾0.8g，蒸馏水100ml。取此液0.5ml(分装于小瓶中，在60以下的烘箱中烘干)，可使5ml血液不凝固。由于草酸钾使红细胞皱缩，
4、草酸铵则使红细胞膨胀，二者按比例混合，可使红细胞大小不致改变，适用于血液检验尤其是红细胞压积容量测定。但由于其具有一定毒性并可使血小板聚集，因此不宜作输血及血小板计数的抗凝剂。2乙二胺四乙酸二钠(简称EDTA二钠)。常用10水溶液，按每5ml血液加入一至二滴使用，也可以将其水溶液二滴置小瓶中，在60以下烘干备用。此剂抗凝作用强，能保持血细胞的形态，可防止血小板聚集，最适于血液学尤其是血液有形成分的检验。但输血时不能用。,3柠檬酸钠。配成3.8溶液，每0.5ml可使5m1血液不凝固，主要用于输血和血沉测定。不适用于血液化学检验。4肝素。配成1水溶液放冰箱内保存，用0.1ml可抗凝5ml血液，用此
5、液湿润注射器筒，采血5ml可不致凝固。此剂抗凝作用强，适用于血液有机和无机成分的分析，缺点是价格贵，抗凝时间短，其抗凝血作白细胞分类计数时，血细胞着色不佳。(二)血样的处理 血涂片应先预以固定。血样最好立即进行检验，否则，必须密封后放入冰箱内保存。用抗凝血作有关化验项目的最长保存时限。白细胞计数是23h，红细胞计数是24h，红细胞压积容量测定是24h血红蛋白测定是23天，血沉测定是23h，血小板计数约1h，网织红细胞计数是23h。,血样的抗凝及处理,三、血液常规检验,（一）红细胞沉降速度测定（二）血红蛋白含量测定（三）红细胞计数（四）白细胞计数（五）白细胞分类计数,红细胞沉降速度测定,(一)原
6、理(二)测定方法(三)注意事项(四)正常参考值(五)临床意义,红细胞沉降速度测定,血液加入抗凝剂后，吸入特制的测定管中，在一定时间内红细胞下沉的毫米数，称为红细胞沉降速度，简称血沉。(一)原理 抗凝血中的红细胞沉降速度的快慢，是一个复杂的物理化学和胶体化学过程，其原理至今仍未完全阐明。一般认为，与血中电荷的含量有关。红细胞与血浆白蛋白带负电荷，而血浆球蛋白，纤维蛋白原和胆固醇却带正电荷，在正常时保持着正、负电荷相对的稳定性，红细胞不易形成串钱状，其沉降速度在正常范围内。在疾病过程中，上述任何一方的数目或含量改变，直接影响正负电荷相对稳定性。假如正电荷增多，则负电荷相对减少，红细胞互相吸附，形成
7、串钱状而血沉加快，反之，红细胞互相排斥，则血沉变慢。此外，认为与红细胞的下沉力和血浆的阻逆力之间是否保持一定的平衡状态有关。,(二)测定方法 测定血沉的方法很多，有六五型血沉管法，魏氏法，潘氏法、温氏法、微量法等。我国兽医临床上主要应用魏氏法。魏(Westergren)氏法：魏氏血沉管全长30cm，内径2.5mm，管壁有200个刻度，每一刻度距离为1mm，自上而下标有0-200，其容量为1m1，附有特制的血沉架。操作时，先取3.8柠檬酸钠溶液1m1，加入小试管内，然后静脉采血4m1，混匀。用魏氏管吸此抗凝血至“0”刻度处，然后在室温下将血沉管垂直放于血沉架上，其观察时间与上法相同。也可用5m1
8、注射器吸取灭菌的3.8柠檬酸钠溶液1m1，再采血4m1，混匀后，从魏氏管下部将抗凝血注至“0”刻度处，立于血沉架上，进行观察。,红细胞沉降速度测定,(三)注意事项 血沉管必须垂直静立，否则会使血沉加快。但由于黄牛，奶牛，羊的血沉极为缓慢，为尽快测出结果，可将血沉架倾斜60角放置。温度高低，能影响血沉速度。温度越高，血沉越快，反之，可使其减慢，故血沉测定以室温20左右为宜。冷藏的血液，应先把血温回升至室温启再做检查。采血后应在3h内测完，如放置时间延长，可使血沉减慢。魏氏法中血液与抗凝剂的比例为4：1，应准确，如比例增加，血沉减慢，反之则血沉加快。,红细胞沉降速度测定,(四)正常参考值 各种方法
9、测得的血沉值不同，故在报告测定结果时应注明所用方法。家畜的血沉正常参考值见表。,(五)临床意义 血沉测定是一项非特异性的试验，仅能说明体内存在病理过程，并不能单独据此来确诊疾病。如前所述，影响血沉的因素，主要是红细胞数和血浆蛋白质的含量和组成，因此，其临床意义主要涉及以下方面。1.血沉加快。常见于各种贫血及白血病时(由于红细胞数减少，血沉加快)，目前仍把它作为普检马传染性贫血的重要指标之一，亦见于急性全身性感染，各种炎症，组织损伤及坏死时(由于血浆球蛋白或纤维蛋白原相对或绝对增高，均可使血沉加快)，恶性肿瘤(由于上述二方面的原因)，而使血沉加快。2血沉减慢。主要见于各种原因所致的脱水而血液浓缩
10、时，以及某些引起纤维蛋白原含量严重减低的肝脏疾患。,红细胞沉降速度测定,血红蛋白含量测定,血红蛋白(简称Hb)测定方法很多，最常用的是沙利(Sahli)氏目视比色法，虽然精确度有一定误差，但方法简便快速，目前仍被兽医临床广泛应用。(一)原理 红细胞遇酸溶解，释出血红蛋白，并被酸化成褐色的酸性血红素，稀释后与标准色柱比色，即可测定每100ml血液中血红蛋白的克数或百分数。,(二)器械和试剂1器械。沙利氏血红蛋白计一套(内有测定管一支，装有标准褐色玻璃比色板的比色座一个，刻有10mm3和20mm3容积的吸血管一支)，在测定管上有两种刻度，从下往上，一侧有224的刻度，表示100m1血液中所含血红蛋
11、白克数，另一侧有20160的刻度，表示100ml血液中血红蛋白的百分数。国产的血红蛋白计是以每100ml血液含14.5g血红蛋白为100而设制。2试剂。110molL盐酸(亦可用1盐酸代替)。取浓盐酸8.5m1于1000m1容量瓶中，然后加蒸馏水至刻度。,血红蛋白含量测定,(三)方法 于测定管内加入110molL盐酸至刻度“2”处。用吸血管吸抗凝血(或耳尖血)至刻度20mm3处，擦净管外壁的血迹，将血液吹入测定管的盐酸液中，再吸取上清的盐酸液至刻度处反复洗涤数次，轻轻摇动测定管(或用玻棒搅拌)，使血液与盐酸混合，静置10min。慢慢沿测定管壁逐滴加入蒸馏水(或110m01L盐酸)，边加边混匀，
12、边观察，直至液体颜色与标准色柱一致时为止。读取测定管内液体凹面的刻度数，即为100m1血液中血红蛋白的克数或百分数。,血红蛋白含量测定,(四)注意事项 要注意保持血红蛋白计原套用具，不要随意掉换。抗凝血要摇匀，吸血要准。不要向测定管中用力吹吸，以防产生气泡，万一产生了气泡，可用小玻棒沾少量95酒精，然后接触气泡，即可消除。静置时间以10min为准，否则结果可能偏高或偏低。为使结果更为准确，在读数后再加蒸馏水1滴，然后读数，如液体色泽变淡，以前一次的读数为准，如液体色泽不变淡，则以后一次的读数为准。,血红蛋白含量测定,(五)正常参考值 一般家畜的正常值。,(六)临床意义 与红细胞计数的临床意义相
13、一致。,血红蛋白含量测定,红细胞计数,计算每mm3血液内所含红细胞数目，称为红细胞计数(Red blood cell count，简称RBC count)。其计数方法有显微镜计数法，光电比浊法，电子计数仪计数法等，目前临床多采用在试管内稀释血液后的显微镜计数法。(一)原理 用适当的稀释液将血液作200倍稀释，滴入计算室后，在显微镜下计数，经过换算即可求得每mm3血液内的红细胞数。经稀释液作用虽仍保留白细胞，但对红细胞计数影响不大，因为一般情况下红细胞与白细胞之比约为1000：1。,(二)器械和稀释液1器械 器械包括以下方面。(1)血细胞计中的计算板。(2)血细胞计中的红细胞吸管。(3)血盖片。
14、(4)沙利氏吸血管，2m1刻度吸管，小试管，显微镜。2稀释液 稀释液主要有以下两种。(1)0.85氯化钠溶液。(2)赫姆(Hayem)氏液。由氯化钠1.0g，结晶硫酸钠5.0g，氯化高汞0.5g,蒸馏水加至200ml，溶解后过滤备用。,红细胞计数,(三)方法 试管稀释法；用2ml刻度吸管吸取红细胞稀释液2ml，置于小试管中用沙利氏吸血管吸血10 mm3(0.01m1)，擦去管外余血，轻轻吹入试管内稀释液底部，再吸上清液冲洗吸管3次，然后立即摇匀。把血盖片覆盖于计算室上，用小玻棒沾取已混匀的红细胞悬液一滴，轻轻接触两者结合处，使悬液自然流入计算室内。静置3min后，即可计数。在镜下计数时，先用低
15、倍(10X)物镜找到计算室中央的大方格(红细胞计数区)，然后转用高倍(40X)物镜，计数中央大方格内四角的4个和中央的一个中方格，共计5个中方格(80个小方格)内的全部红细胞数(或用对角线的方法数5个中方格)。为避免重复和遗漏，计数时要按一定的顺序进行。并且对压在方格左边和上边线上的红细胞均计在本格内，数左不数右”的计数原则。,红细胞计数,计数完毕，可按下列公式计算：R/80*400*200*10=1mm3 血液中红细胞总数 R为5个中方格(即80个小方格)内的红细胞总数，400为一个大方格(即1mm3面积)内共分400个小方格，200为稀释倍数(实际稀释201倍，即稀释液2m1，吸血0.0l
16、ml。为方便起见，可忽略不计)，为了换算成1mm容积内的红细胞数，因为盖片与计算室之间的深度为0.1mm,所以要乘10。上式简化后为：R*l0，000=红细胞数mm3血液,红细胞计数,(五)正常参考值 我国幅原辽阔，各地环境条件，海拔高度不同，又受家畜年龄，性别等因素的限制，即使同一品种的动物，红细胞数亦有一定差异。各地报道数据有所不同。,红细胞计数,(六)临床意义 红细胞数与血红蛋白含量的病理变化通常是平行一致的，表现为增多或减少，因而其临床意义基本相同。只是在某些类型贫血时，两者的减少程度可能不相一致，需要计算红细胞平均指数才能准确鉴别。1红细胞数增多和血红蛋白含量增多。临床上绝大多数为相
17、对性增多，而绝对性增多较少见。(1)相对性增多。是由于机体脱水，造成血液浓缩的缘故。如剧烈腹泻，呕吐，大出汗，多尿，大面积烧伤，渗出液和漏出液大量形成、饮水不足等。(2)绝对性增多。由于各种生理或病理性因素(如缺氧)刺激骨髓使造血机能增强，导致红细胞绝对数增多，见于高原地区的动物和严重的慢性心肺病以及真性红细胞增多症。2红细胞数减少和血红蛋白含量减少。主要是由于红细胞损失过多或生成不足二方面的原因，见于各种类型的贫血。这二项指标的改变是确定贫血程度以及观察疗效的主要依据，但要进一步确定贫血原因和类型，还应配合其他血液检查(如红细胞压积容量测定和血片染色观察等)和临床症状综合分析。贫血的分类，通
18、常有形态学分类(参阅红细胞平均指数的计算一节)和病因学分类两种方法，二者互相结合则有助于贫血的诊断和治疗。现按病因学分类法简述如下：(1)失血性贫血。(2)溶血性贫血。(3)营养不良性贫血。(4)再生障碍性贫血。,红细胞计数,白细胞计数,计算每mm3血液内白细胞的总数，称为白细胞计数(，简称WBC)。目前兽医临床仍以试管稀释后经显微镜计数的方法为主。(一)原理 用稀酸溶液破坏红细胞，保留白细胞，再行计数。(二)器械与稀释液 1器械：除白细胞吸管外，其他与红细胞计数相同。2稀释液：13冰醋酸溶液，内加数滴结晶紫使呈淡紫色，以便与红细胞稀释液相区别，并可使白细胞核略为着色。,(三)方法 试管稀释法
19、的操作过程大体上与红细胞计数相同。在小试管内加入白细胞稀释液0.4m1(实际应为0.38m1)吸血20mm3，立即吹入稀释液中，混匀。用小玻棒蘸取已混匀的检液一滴充填入计算室内，静置3min后计数。用低倍镜将计算室四角4个大方格内的全部白细胞按顺序计数，对压线细胞的取舍原则同红细胞计数。最后，可按下列公式计算：W/4（四个大方格）*10（换算为1 mm3）*20（稀释倍数）=1 mm3血液中白细胞总数,白细胞计数,（四）正常参考值,家畜白细胞数正常参考值,白细胞计数,(五)临床意义1白细胞增多。在大多数急性细菌性感染，尤其是金黄色溶血性葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌等感染时，白细胞数明显升高。当
20、组织器官发生急性炎症，如肺炎，胃肠炎，子宫炎、乳房炎，创伤性心包炎等，特别是化脓性炎症，可引起白细胞明显增多。在严重的组织损伤，急性大出血，急性溶血，某些中毒(酸中毒，敌敌畏中毒，尿毒症等)以及注射异体蛋白(血清、疫苗等)后，白细胞数均可增多。白血病时，白细胞数持久性，进行性增多。2白细胞减少。见于病毒性感染时，如猪瘟，流行性感冒，马传染性贫血等，伴有再生障碍性贫血的疾病，此外，在严重感染、高度衰竭以及内毒素性休克时，可见白细胞数减少。,白细胞计数,白细胞分类计数,通过显微镜观察染色血片，计算血液中各类白细胞的百分率，称为白细胞分类计数（简称DC）。利用白细胞总数和各类白细胞的百分数率，即可计
21、算出每mm3血液中各类白细胞的绝对值。白细胞分类技术对疾病的诊断、预后及疗效观察具有重要意义。（一）器械和染色液 1器械 器械包括以下方面。（1）载玻片。(2)染色盆、染色架，显微镜及镜油等。2染色液 瑞氏(Wright)染液。瑞氏染料1.0g，甲醇(分析纯)600ml。将染料置于研钵中，加少量甲醇研磨，使其溶解，将已溶解的染液倾入棕色瓶中。对未溶解的染料再加入少量甲醇研磨，直至染料溶完，甲醇全部用完为止。在室温中保存一周，过滤后备用。新配染液偏碱，如放置越久，则天青形成越多，染色越好。配制时可在染液中加中性甘油30m1，以防止染色时甲醇挥发过快，并使细胞着色清晰。,(二)方法1涂片 用左手的
22、拇指与中指夹持一张载玻片，先以细玻棒取血一小满(最好是未加抗凝剂的新鲜血)置载玻片的一端，然后右手持另一张边缘平滑的推片(最好此载玻片稍窄或磨去两角)，倾斜3045角，由血滴的前方向后接触血滴，待血液扩散成线状后，立即以均等的速度轻而平稳地向前推进，直至血液推尽为止。涂片时，血滴越大，角度越大，推片速度越快，则血膜越厚，反之则血膜越薄。白细胞分类计数的血片宜稍厚，进行红细胞形态及血原虫检查的血片宜稍薄。一张良好的血片，要求厚薄适宜，血液分布均匀，边缘整齐，能明显分出头，体，尾三部分，两侧留有空隙(以写明畜别，编号、日期)。血膜分布不匀，主要是由于推片不齐，用力不匀，玻片不洁所致。推好的血片可在
23、空气中挥动，使其迅速干燥，以防细胞皱缩变形，并尽快固定染色。2染色 瑞氏染色法：用蜡笔在血膜两端划线，以防染液外溢。将血片平置于染色架上，滴加瑞氏染液，并计其滴数，以盖满血膜为度。约1min后，再滴加等量的磷酸盐缓冲液，轻摇玻片或吹气，使之混匀。约510min后，用蒸馏水直接冲洗(切勿先倾去染液再冲洗，否则沉淀物附于血膜上而不易除去)，干燥后可供镜检。,白细胞分类计数,涂片,3分类计数 先用低倍镜全面观察血片上细胞分布情况及染色质量，然后选择染色良好，细胞分布均匀的部分，用油镜进行分类。由于比重大的细胞(粒细胞，单核细胞等)多分布在血片的边缘和尾部，比重小的细胞(如小淋巴细胞等)则多分布在血片
24、的头部和中间。为减少这种细胞分布的固有误差并避免重复计数，血片必须按一定方向曲折移动而分类计数，并且分类计数的白细胞总数至少要达100个(如果计数200300个白细胞，当然其百分率更为准确)。记录时，可用白细胞分类计数器，或设计一个表格，用画“正”字的方法加以记录。某种白细胞绝对值；白细胞总数mm3某种白细胞的百分率,白细胞分类计数,(三)各类白细胞的形态特征 在镜下辨认各种白细胞时，必须掌握其主要特征，如细胞大小，核的形状结构及染色性，胞浆颜色、有无颗粒及颗粒特点等。在同一张血片上对照比较，互相鉴别。1嗜中性白细胞。圆形，直径约1015m。胞浆淡红色，胞浆内有多量紫红色细小颗粒(染色不佳时则
25、看不清楚)。核染成深紫色，其形状多样，核微呈肾形，染色稍淡的称幼年核，呈带形或S形，两边平行的称杆状核，分成23叶，在叶之间有细丝相连的 称分叶核。有时因核叶重叠看不到细丝，但核量较多，染色质致密，也可认为是分叶核。2嗜酸性白细胞。大小，形态与嗜中性白细胞大体相似，唯胞浆内含有粗大的鲜红色颗粒(马的这种嗜酸性颗粒明显大于其它家畜)。核多数为两叶。3嗜碱性白细胞。大小、形态与嗜中性白细胞相似，但胞浆内含有粗大的深蓝色颗粒，常遮盖在核上。核分叶不明显。4淋巴细胞。分大小两种，小淋巴细胞圆形，直径约710m，核染成深紫色，圆形或肾形。胞浆很少，常仅呈一小片月牙状，染成蓝色。大淋巴细胞直径约1019m
26、，核圆形或肾形。胞浆相对较多，染成天蓝色，在胞浆与核之间有淡染带。有时内含少数紫红色大颗粒。5单核细胞。是外周血液中最大的细胞，直径约为1224m。核染成紫色，其染色质疏松，核形不规则，呈肾形，多角形，折叠状等。胞浆较多，染成浅灰蓝色，有时内含少量灰尘样淡红色小颗粒。,白细胞分类计数,马,牛,羊,骆驼,鸡,猪,家畜各种白细胞百分比正常参考值,白细胞分类计数,(五)临床意义 白细胞总数的变化，能反映机体防御机能的一般状态，因而具有一般的诊断意义，而白细胞分类计数则能进一步反映机体防御机能的特殊状态，在诊断上具有深刻的意义。所以在分析临床意义时，必须把二者结合起来，全面考虑。某种白细胞的绝对值及其
27、百分比均增加，称为某种白细胞的绝对性增多，如果其绝对值正常，而百分比增加是由于另一类白细胞的百分比减少所致，则称为某种白细胞的相对性增多。在分析病情时必须注意这一点。1嗜中性白细胞。属非特异性免疫细胞，是急性炎症初期的主要细胞成分。临床上，白细胞总数增高和降低常常与嗜中性白细胞增减直接相关。(1)嗜中性白细胞增多。(2)嗜中性白细胞减少。(3)嗜中性白细胞的核象变化。（4）嗜中性白细胞的中毒性变化。,白细胞分类计数,2嗜酸性白细胞。一般认为与过敏反应有密切关系。(1)嗜酸性白细胞增多。见于过敏性疾病、寄生虫病、皮肤病(如湿疹)，应激反应的抗休克期及感染性疾病的恢复期。(2)嗜酸性白细胞减少。见
28、于感染性疾病或严重热性病的初期乃至极期，骨髓机能高度受害，应用皮质类固醇药物及应激反应的休克期。嗜酸性白细胞长时间消失，表明预后不良。但消失后又重新出现，则表示病情好转。3淋巴细胞。属特异性的免疫细胞，参与体液免疫和细胞免疫。(1)淋巴细胞增多。(2)淋巴细胞减少。4单核细胞。对病原体(尤其是一些能形成肉芽肿性炎症反应的病原体)、组织坏死碎片和死亡的细胞等大分子颗粒有较强的吞噬能力，往往是炎区后期的主要细胞成分。同时参与特异性免疫过程。(1)单核细胞增多。(2)单核细胞减少。5嗜碱性白细胞。在一些慢性变态反应性疾病，高脂血症，伴有IgE长期刺激的疾病(如犬慢性恶丝虫病)，白血病的一个时期，出现嗜碱性白细胞增多。,白细胞分类计数,
