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1、第三节 培养条件的选择与控制 植物细胞、组织、器官无菌培养与多种条件或因子有关，培养条件是整个组织培养的难点和重点。培养条件包括 光照-能量的来源 温度-新陈代谢的实现 湿度-气-水平衡的保证 培养基-外植体（植株）营养的来源,一、温度 一般植物在细胞、组织培养中正常的诱导、分化、增殖、生根的温度是（252），低于10会停止生长，高于33则会抑制生长、发育，甚至褐化死亡。植物细胞、组织培养生长的最适温度一般与该植物正常生长的最适温度一致。喜冷凉的植物，组织培养温度要求较低，以20左右为好；喜温暖的植物，组织培养温度要求较高，以25左右为好。,谷迎春等在研究黄金球切花菊组织培养时发现，温度对菊花
2、试管苗生长有显著影响：温度在28时，试管苗长得最高，但增殖倍数低，仅为4.22倍；温度在26时，其增殖倍数最高，为5.63倍。可见，分化增殖过程中，温度保持在26左右，有利于苗的分化。同时温度在26，其根长和生根条数都远远超出其它两个处理，所以，试管苗生根的最佳温度也是26。,低温处理在植物组织培养中也是用得较多的措施之一，因为它能促进器官分化，提高诱导、分化频率。常用的低温处理方法有以下3种：（1）接种前低温处理。（2）接种后低温处理。（3）组培苗的生根和移栽的低温处理。,二、光照 光照的影响表现在光照时间、光照强度、光周期三个方面。对于大多数植物，每天1416小时的光照，810小时的黑暗即
3、可保证正常生长、发育的需要。植物组织培养通常以碳源作为能源，光照主要是满足形态建成的需要。光周期对诱导和花芽的形成有明显的影响。,三、气体 任何植物在进行细胞、组织培养时，都要进行光合作用和呼吸作用。在一定气体（包括O2和CO2）的动态平衡下，培养物得以正常的生长、分化、发育。传统植物组织培养方式下封闭式小容器内光照弱，CO2亏缺，空气温度过高，容易累积乙烯等有害气体是造成培养小植物体生长缓慢、弱小和移栽成活率低的重要因素。在进行液体培养时，必须经常转动或使用震荡摇床进行震荡培养，促进培养物的氧气交换，才能充分发挥液体培养高效的增殖作用。,四、渗透压渗透压与植物细胞、组织的生长和分化关系密切。
4、在培养基中添加食盐、蔗糖、甘露醇和乙二醇等物质可以调整渗透压。通常12个大气压可促进植物细胞、组织生长，2个大气压以上时，出现生长障碍，6个大气压时植物细胞、组织即无法生存。,五、酸碱度 一般植物细胞、组织生长的最适宜pH为56.5。但进行植物转基因操作时，其中在进行共培养阶段时，必须保证较低的pH值。若在培养过程中pH发生变化，可加进磷酸氢盐或二氢盐，起稳定作用。六、湿度 通过封口膜的包扎或培养瓶盖的限制，使得培养容器内形成了独特的小环境，此时培养容器内的相对湿度一般为60%80%。,第四节 基本技术 植物细胞工程中涉及的技术很多，在植物组织培养阶段，基本的技术环节包括外植体的选择、灭菌和消
5、毒、无菌操作、继代培养、组培苗的生根和移栽等。一、外植体的选择 外植体是指植物离体培养中的各种接种材料。包括植物体的各个器官、组织、细胞的原生质体等。决定外植体培养成败的重要因素除了培养基的成分外，就是外植体的种类和来源。尽管从理论上讲，植物细胞都具有全能性，能够再生新植株，但实际上，不同植物种类或品种、不同器官之间的分化能力存在巨大的差异。,外植体一般分为三类。*带芽的外植体，如茎尖、侧芽、鳞芽、原球茎等，组织培养过程中可直接诱导形成丛生芽的。其获得再生植株的成功率较高，变异性也较小，易保持材料的优良性状。*根、茎、叶等营养器官和花药、花瓣、花轴、花萼、胚珠、胚、子房、花药、花粉、果实等生殖
6、器官以及贮藏器官的薄壁组织、维管束组织。这一类外植体需要进行脱分化，经过愈伤组织阶段，再分化出芽或产生胚状体等，才能形成再生植株。*细胞或原生质体，培养后通过直接或间接发生途径发育成植株，但在培养过程中要保证这些细胞或原生质体的渗透压，防止破裂或结构的崩溃。,外植体的取用与组织部位、植株年龄、取材季节以及植株的生理状态、质量，都对培养时器官的分化有一定影响。1外植体部位 不同种类的植物以及同一植物的不同器官对诱导条件的反应是不一致的，有的部位诱导分化的成功率高，有的部位很难脱分化或者再分化频率很低。例如，同一百合鳞茎的不同部位之间的再生能力差别较大，外层鳞片比内层鳞片的再生能力强，下段比中、上
7、段再生能力强。,2取材季节 外植体的取材季节也是影响因素之一。一般在生长季节如春季、秋季比其它季节容易分化。如马铃薯，在4月和11月取得的茎叶外植体有较高的块茎发生能力，而在23月或511月的外植体，则很少有块茎发生能力。对于大多数植物而言，在生长开始的季节取材比较适合。,3器官的生理状态和发育年龄 一般认为，沿着植物的主轴，越向上的部分，所形成的器官的生长时间越短，其生理年龄也相应越老，越接近发育上的成熟。反之，越向基部，其生理年龄越小。因此顶芽比腋芽容易分化；萌动的芽比休眠芽容易分化。如在石莲花叶的培养中，用幼小的叶作培养材料，仅产生根，用老叶片培养可以形成芽，用中等年龄的叶片培养，既可以
8、产生根，也能产生芽。,4、外植体大小 外植体的大小也与培养的成功有密切的关系。外植体材料太小培养成活率低，分化能力差，材料太大，消毒灭菌效果差。选取培养材料的大小一般在0.51.0厘米之间。同时为了培养脱毒种苗，常用茎尖分生组织部，长度为0.1毫米以下，需要在解剖镜下切取。,二、灭菌和消毒（一）培养基的灭菌和消毒1.培养基的湿热灭菌 培养基的灭菌一般采用高压灭菌锅进行湿热灭菌。培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是：在密封的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而高压锅内的温度也随之增加。在1.051.1 MPa的压力下，温度达121C。从而杀死各种
9、细菌及其高度耐热的芽孢。一般消毒1520分钟。,培养基或无菌水的最少灭菌时间,高压灭菌后的培养基，通常会产生一些变化：（1）、pH值会上升0.20.3单位。（2）、蔗糖水解为单糖，从而改变培养基的渗透压。在8%20%蔗糖范围内，高压灭菌后的培养基渗透压约升高0.43倍。（3）、培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖分解，使15%25%的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。培养基pH值小于5.5，其水解量更多。培养基中加入0.1%活性炭时，高压下蔗糖水解大大增强，添加1%活性炭，蔗糖水解率可达5%。,为了防止高压灭菌产生的上述变化可用下列方法：（1）经常收集相关文献资料，以便及时采取有效措施。（2）设计培养基配
10、方时，尽量采用效果类似的稳定试剂并准确掌握剂量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBA代替IAA，控制活性炭的用量（在0.1%以下），注意pH值对高压灭菌下培养基中成分的影响等。（3）配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序。如将磷、钙、铁放在最后加入。（4）注意高压灭菌后培养基pH值的变化及回复动态。如高压灭菌后的pH值常常由5.8上升到6.48，而96小时后又回降到5.8左右。,（二）用具的灭菌和消毒1用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌 在无菌操作时，把镊子、剪刀、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用时放在酒精灯上灼烧灭菌，冷却后进行无菌操作。完毕后再插入95%的酒精中消毒灭菌。也可以用高
11、温灭菌器消毒，快捷方便，但成本较高。,2.玻璃器具及耐热用具采用干热灭菌 利用烘箱加热到160C180C灭菌90 分钟。玻璃器具用耐高温塑料包扎，避免再次污染。但该方法较耗能源，若材料耐压，可尽量用高压灭菌锅灭菌。对于一些布制品，如实验服、口罩等也可用该法或高压灭菌锅灭菌。,3.非耐热的液体物质的过滤灭菌 由于高压高温灭菌会引起一些化合物的分解和破坏，故对于植物细胞工程和组织培养中常用的抗生素（卡那霉素、头孢霉素等）、激素（如赤霉素、玉米素、脱落酸等）、维生素等不能用高压灭菌，必须进行过滤灭菌。利用网径在0.45微米以下的防细菌滤膜，当溶液通过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被
12、阻。,4.空间采用紫外线和熏蒸灭菌（1）紫外线灭菌。以260 nm的杀菌能力最强。但紫外线的穿透能力很弱，故只适于空气和物体表面消毒，且要求照射距离不超过 1.2 m。紫外线灭菌时间为3045分钟，关掉紫外线灯后十多分钟即可入内操作。（2）熏蒸灭菌。常用的熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，密闭房间，按58毫升/m3用量，将甲醛置于广口容器中，加5g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时房间内应预先喷湿以加强效果。冰醋酸也可进行熏蒸，但效果不如甲醛。,5.物体表面灭菌 对于桌面、墙面、双手、植物材料表面等，可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如用7076%的酒精反复涂擦双手灭菌。或用12%的来苏儿溶液以及0.251%的新洁
13、尔灭菌。,（三）外植体的灭菌和消毒 由于培养的植物材料大都采集于田间或圃地的栽培植株，材料上常附有各种微生物，一旦被带入培养基，即会迅速繁殖滋长，造成污染，培养失败，人力、物力、财力受损失。所以培养前必须采用消毒剂灭菌对外植体进行严格的灭菌和消毒处理。原则是既能全都杀灭外植体上附带的微生物，但又不伤害材料的生活力。因此，必须正确选择消毒剂和使用的浓度、处理时间及程序。,植物外植体材料常用消毒剂及其效果,将采来的植物材料先进行初步处理，即先除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，再将材料切割成适当大小，即灭菌容器能放人为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料清洁程度而宜。易漂浮
14、或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重时特别有用。洗时可加入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲净洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物，除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触。,（1）茎尖、茎、叶片的灭菌和消毒（2）根、块茎、鳞茎的灭菌和消毒（3）果实、种子的灭菌和消毒（4）花药、花粉的灭菌和消毒,三、无菌操作 无菌操作是贯穿于整个植物组织培养过程的一门关键技术，甚至可以说组织培养的前提就是无菌。从外植体的制备到其后的一系列操作都是在无菌环境下进行的。无菌操作者的操作手法和习惯也是无菌操作成功与否的关键。要对进行无菌操作的实验人员经过严密的无菌操作训练并建立严格的“无菌概念”，
15、同时作好严格的实验操作记录和记载，一般及时发现问题，解决问题。否则一旦产生了污染，还不知道污染的原因何在。,四、外植体的培养方式 外植体的培养方式一般有固体培养和液体培养两种方式。*固体培养是指在培养基中加入凝固剂，。凝固剂一般为琼脂，浓度为0.61.0%（g/L）。最大优点是简单，易观察，对外植体的损伤较小。但其缺点是培养物只有底部的表面与培养基接触，造成培养材料各部分营养浓度的差异，影响生长。也容易造成代谢产物的积累，影响组织吸收养分和造成毒害。另外，培养物的受光也不均匀，细胞群生长不一致。,*液体培养则是在培养基中不加入凝固剂。它分为静止培养和振荡培养。静止培养是用滤纸桥作支持物，外植体
16、放在滤纸桥面上，通过滤纸桥纤维的毛细管作用把养分吸收上来供外植体使用。现在采用的液体培养大多数是振荡培养(复式摇床)。外植体在液体培养基中不断转动。,五、增殖和继代培养（一）增殖 当外植体被接种一段时间后，应将已形成的愈伤组织或已分化而成的培养物进行分割，转接到新的培养基上，进一步扩大增殖培养。,1芽增殖 高等植物的每一叶腋中通常都有腋芽，在离体培养条件下，培养基中加入适当浓度的细胞分裂素，或除去顶端不加任何激素，即可以使腋芽伸长或长成丛芽，通过芽增殖的方式进行快速繁殖的特点主要表现在培养方法简单，后代能保持高度的遗传稳定性，虽经过长期离体繁殖，仍能保持高度的遗传稳定性。,2不定芽增殖 从原有
17、的芽以外的任何器官和组织通过器官发生重新形成的芽称为不定芽。在自然条件下，许多植物的器官可以产生不定芽，诱导不定芽时，需要在培养基中添加外源激素，细胞分裂素一般高于生长素。,3愈伤组织增殖 几乎所有的植物都可以通过组织培养的方法诱导形成愈伤组织，愈伤组织可以继续增殖，愈伤组织再进一步分化获得小植株。这一增殖途径经历了组织培养技术的所有过程：愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖、芽与根的分化、完整植株的形成等。愈伤组织增殖的特点是成功率高，繁殖系数大，但遗传稳定型较差。对于遗传稳定性要求高的植物种类或品种，一般不采用此途径解决增殖问题。但利用其遗传性状不稳定的特点，可以比较容易地获得变异。,4胚状体增
18、殖 在离体培养是条件下，有些植物能发育形成体细胞胚，胚状体形成后，应及时转移到低浓度的或不含生长素的培养基中，以便其成熟。胚状体增殖的特点是增长率高，所形成的试管苗免去了生根的环节。但胚状体的诱导难度较大。,（二）继代培养 进行继代培养时，必须根据植物自身的生长习性和不同基因型的特点，确定继代时间、继代培养基、继代周期等。如平贝母愈伤组织在经过体胚发生和不定芽发生两个途径形成再生植株的过程中，体胚发生的最佳继代周期时间为21d，不定芽发生的最佳继代周期时间为28d；继代时间越长，体胚及不定芽发生的频率越低，平贝母愈伤组织继代25周后体胚发生能力迅速降低，继代30周后，不定芽发生能力迅速降低。,
19、六、组培苗的生根和移栽 试管苗是在无菌、有营养供给、适宜光照、温度和几乎100%的相对湿度的环境中生长的，一旦出瓶移栽环境发生了剧烈变化而不利于其生长；同时由于试管苗幼嫩，环境中的杂菌极易侵染，稍一不慎就会造成大量试管苗死亡。因此组培苗在经过了分化、增殖、继代后，还需要经过壮苗、生根、炼苗、移栽以及旺盛生长的一系列过程。,（一）壮苗 在组培苗生根前，一般必须有一个壮苗的过程。即将丛生苗分割成单苗，使其茎干变粗，叶色浓绿。或将胚状体、原球茎、根状茎等中间繁殖体转移到生芽培养基上，获得健壮的组培苗。培育壮苗可以在培养基中加入多效唑、B9、CCC等植物生物延缓剂；还可以通过降低温度、增强光照等途径，
20、以达到株高35cm，若苗过于细长则难以移栽成活。,（二）生根当植物试管苗植株健壮，根系发达时，就必须适时生根，从而达到快速繁殖的目的。常用的生根方法有：（1）了解种类和品种的差异。（2）适当延长在增殖培养基中的培养时间，直至根系长出并达到一定的长度。（3）通过研究发现矿质元素浓度较高时有利于发展茎叶，较低时有利于生根，故生根培养基多采用1/2或1/4 MS培养基。,（4）有意减少一些增殖率，同时细胞分裂素没有或浓度较低，而使用适量的生长素浓度促进生根，常用的生长素是NAA。（5）切割健壮试管苗在适宜基质内进行扦插生根。这是一种降低成本的好方法，但必须事先经过预试验已摸索扦插技巧和促进生根的措施
21、。（6）从胚状体发育的小苗，常常带有原先已分化的根，可以不经过诱导生根阶段，但因经过胚状体途径发育的幼苗数量较多，仍需要经过一个低的或没有植物激素的培养基培养阶段，以便壮苗生根。,（三）炼苗 组培苗的移栽生根或形成根原基的试管苗从无菌，温、光、湿度稳定环境中进入到自然环境中，从异养过渡到自养过程，必须经过一个炼苗过程。炼苗是组培技术中较为关键的一环，它直接关系到组培苗能否尽快地在苗床或苗圃中生长，并较快地应用到大田生产中去。,（四）移栽和管理 与移栽和管理最有关的因素是环境因子。1.温度 试管苗比较娇嫩，它从培养瓶中移到苗床或苗圃中，应使温度尽可能同培养室的一致。2.水分 试管苗在移栽前期由于
22、根系尚不能从基质中充分吸取水分，故保持试管苗的水分供需平衡是试管苗成活的关键之一。,3.光照 由于培养基中糖的作用，使试管苗的叶片光合作用能力较低。移栽前应逐步加强光照，使叶片恢复光合作用能力。但不宜长时间强光强射，以免叶片受损或灼伤，致使小苗随着蒸腾失水而萎蔫。但若光线不足就会造成茎叶徒长、瘦弱，不易获得壮苗。4.湿度 培养容器内空气相对湿度常维持在高湿状态（95%l00%）下，且达饱和状态时出现结露现象。高湿使小植物体茎叶表面防止水分散失的角质层薄、发育差，气孔开闭功能不健全，根系也不发达或无根，种植后难以保持水分平衡。,5.基质 移栽苗床或苗圃的基质必须具备疏松通气、适宜的保水性、清洁卫生的特性（灭菌处理）。这样既可保水又利于通气，因而有助于根的成活。6.肥料 试管苗移栽前期的根系生长主要靠消耗自身积累的养分，如果不及时补充养料就合影响后期幼苗的健壮和快速生长。移栽23d后，即可用浓度较低的营养液进行叶面喷施，以快速补充养料，促进根系的正常和培育壮苗。,
