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1、,园艺植物的分子标记 1 概述 2 常用分子标记技术原理及操作 3 分子标记在园艺植物中的应用,1 概述 1.1 基本概念世间万物遗传多样性（遗传变异）遗传多样性（遗传变异）：遗传信息的总和，种内不同群体之间或者一个群体内不同个体的遗传变异的总和。遗传标记：是指可追踪染色体、染色体某一节段或者某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。是表示遗传多样性的有效手段，可以明确反映遗传多态性的生物特征。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性。,性状标记（morphological marker）细胞学标记（cytological marker）生化标记（biochemical marker）分子标记
2、(molecular marker),形态标记（morphological marker）是指那些能够明确显示遗传多样性的外部形态特征。特点：1.简单直观、经济方便 2.数量少 3.易受环境影响 4.一些标记与不良性状连锁 5.周期长,细胞学标记（cytological marker）细胞有丝分裂的中期和早后期染色体的核型和染色体显带技术。特点：1.不受环境影响 2.能进行一些重要基因的染色体区域定位 3.材料来源难,生化标记（biochemical marker）主要包括同工酶、等位酶和贮藏蛋白标记，是指利用植物代谢过程中的具有特殊意义的生化成分或产物进行遗传多样性标记的技术。特点：1.表现
3、近中性，对植物经济性状一般没有大的不良影响；2.直接反映基因产物的差异，受环境影响小；3.有些生化大分子分离困难,遗传标记（Genetic marker）,性状标记（morphological marker）细胞学标记（cytological marker）生化标记（biochemical marker）分子标记(molecular marker),多态性少标记数量有限以 基因表达结果（表现型）为基础，是对基因的间接反映,DNA分子标记有其独特的优势:(1)直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题；(2)自然界存在许多等位变异
4、，无需人为创造，多态性高；(3)遍布整个基因组，可检测的基因座位是无限的。,以DNA碱基序列变异为基础，是DNA水平遗传变异的直接反映,分子标记 广义的分子标记是指可遗传的、可检测的、与生物的表性性状连锁的DNA序列或蛋白质。狭义的分子标记只是指DNA标记。,1.2 DNA分子标记的发展历史及类型 第一类分子标记：以Southern杂交为基础的分子标记技术 RFLP（1974）第二类分子标记：以PCR为基础的分子标记技术 SSR（1982）、RAPD（1990）、AP-PCR（1990）、AFLP（1993）、ISSR（1994）、SAGE（1995）第三类分子标记：以单核苷酸多态性为基础的分
5、子标记技术 SNP（1998）、SRAP（2001）、TRAP（2003）,1.3 DNA分子标记产生的分子基础,PCR技术：polymerase chain reaction 限制性内切酶：restriction endonuclease,电泳：带电荷的物质在电场中的趋向运动。核酸电泳：核酸分子由于带负电荷，在电场中向阳极定向运动。根据核酸电泳的介质可以分为琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳。同一种核酸分子由于大小、电荷数相同，在电场电势和介质阻力固定的情况下，应当具有相同的迁移速率，而不同大小的核酸分子迁移率不同，从而加以分离。,三种情况：1.DNA 序列酶切位点（或PCR引物
6、结合位点）处的碱基发生突变，导致酶切位点（或者PCR引物结合位点）消失、酶切产物（或者扩增产物）减少。,W,M,W,M,M,W,酶切产物电泳,PCR扩增产物电泳,2Kb,3Kb,3Kb,2Kb,2.DNA 序列酶切位点（或PCR引物结合位点）之间缺失（或插入）了一段核苷酸序列，或者是酶切位点（或者PCR引物结合位点）之间的串联重复单元数目发生了改变，导致酶切产物（或者扩增产物）片段长度发生了改变。,W,W,W,W,W,W,M,M,M1,M2,M,M,M1,M2,4Kb,1Kb,5Kb,5Kb,4Kb,5Kb,4Kb,1Kb,5Kb,4Kb,4Kb,5Kb,3Kb,5Kb,4Kb,3Kb,3.单
7、核苷酸突变，即DNA序列发生了单碱基转换（A与T或C与G）或颠换（A、T与C、G）,ATCGAATGCGCATCGATTGCCCATCGAATGCACACCGAATGCGC,W,W,M,M,2 常用分子标记方法2.1 限制性片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)RFLP标记是用限制性内切酶酶解具有相对性状的两个群体的DNA，然后通过电泳和Southern杂交技术在酶切后形成的DNA片段中发现这种不同。这种不同就是目的性状的RFLP标记。,特点：1.遍布，无限2.不受外界环境、发育阶段、器官等影响3.探针多4.DNA需求量
8、大，纯度高5.技术要求高，成本大,RFLP的基本步骤：1、DNA的提取 碱法、CTAB、SDS,2、用限制性内切酶酶切DNAEcoR 5gDNA 10U 终体积30-40l3、核酸电泳,4.核酸杂交 核酸分子杂交是指非同一分子来源但具有互补序列（或是某一区段互补）的两条多核苷酸链，通过碱基互补配对原则形成稳定的双链分子的过程。若其中的一条链被认为标记上，该标记可以通过某种特定方法检出，即成为所谓的探针。探针是指经特殊化合物标记的、特定的、已知的核苷酸序列。探针与其互补的核苷酸序列杂交后，杂交体也就带上了同样标记，可被检测出来。这样，我们以特定的已知核苷酸序列为探针就可以在诸多的核苷酸序列中找到
9、所需核苷酸。核酸杂交包括Southern杂交、Northern杂交。蛋白质分子杂交是利用抗原与抗体特异结合的原理来进行检测的，称为Western杂交。,探针的标记：同位素标记、生物素标记（地高辛标记，Digoxigenin）,支持物,重 物,转移缓冲液,Whatman 3MM 滤纸,杂交膜,吸水纸,注意事项：DNA要完整，纯度要高气泡多种酶,2.2 随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)建立于PCR 技术基础之上的一种技术。它分别以具有相对性状的基因组DNA为模板，以一个10bp随机寡核苷酸作引物进行PCR扩增反应，在扩增产物中查找与
10、目的性状相连锁的DNA片段（即差异片段），获得的片段就是目的性状的RAPD标记。,特点：试验步骤少；没有物种特异性；技术简便；DNA样品量少；易发现多态性；显现标记重复性不高；存在共迁移问题,基本步骤：1、DNA的提取；2、用随机引物对两个相对性状个体进行PCR扩增；（1）模板（2）引物（3）缓冲液（4）Mg2+（5）dNTP（6）耐热DNA聚合酶 变性、退火、延伸 3、用凝胶电泳分开产物DNA片段；4、查找特异的与目的性状共分离的DNA片段；,注意事项：冰上加样操作；DNA质量；反应灵敏，防止污染；影响因子多，要调体系；琼脂糖凝胶-聚丙烯酰胺凝胶；转变为别的标记,DNA指纹技术(DNA fi
11、ngerprinting，DNF)原理与RAPD技术相同，不同的是，在DNF分析中，引物浓度更高，引物长度更短，一般6个碱基，产物片段比较小且极为丰富，往往用聚丙烯酰胺凝胶电泳，DNF通常会产生非常复杂的带型。,任意引物PCR(Arbitary primer PCR，AP-PCR)武断的选择一个非特异性引物，在标准的PCR体系中，首先在不严格的条件下使引物与待分析的DNA序列通过错配而复性，如果两个引物之间的序列符合扩增的条件则可以进行扩增，再后期严格的扩增条件下产生指纹图。引物的选择：M13-20测序引物影响因素：盐浓度、复性温度、模板浓度、引物浓度,操作步骤：DNA的提取PCR反应：先宽松
12、后严格电泳观察分析,2.3 序列特征扩增区域(sequence characterized amplified region，SCAR)先做RAPD或DNF分析，然后把标记片段测序，根据片段两端的序列设计一对特定引物（通常16-24个碱基），再对具有相对性状的两个基因组进行PCR特异扩增，这样就可把与相对性状对应的序列单一扩增出来。这样的DNA片段与原先的性状存在对应关系，就称为该性状的SCAR标记。,Random primer,Random primer,specific primer 1,specific primer 2,RAPD marker,SCAR marker,Sequencin
13、g,SCAR比RAPD和其它利用随机引物的方法在基因定位和作图中的应用更好，因为它有更高的可重复性（原因是使用的引物长）。,SCAR的操作过程：RAPD标记技术分析；回收特异RAPD扩增片段；RAPD产物克隆与测序；RAPD产物特异引物设计；特异引物引导下的PCR反应；电泳获得SCAR标记。,2.4 简单序列重复标记（simple sequence repeat，SSR）真核生物基因组含有分散重复序列和串连重复序列两种类型的重复序列。根据重复序列的长度、拷贝数和位置等又将串连重复序列分为卫星DNA（基序长100300bp）、小卫星DNA（基序长1060bp）、微卫星DNA（基序长16bp，如
14、CA、CTCG）等几种类型。,SSR根据简单重复序列外两翼的特定短序列设计引物，用来扩增重复序列本身，由于重复的长度变化极大，所以会得到不同长度的片段。如果扩增出来的某个片段与某个特定性状存在对应关系，则该片段为该性状的SSR标记。,SSR原理,重复单元：1 6bp,如 CA,CTCG 重复次数：5 30 次 覆盖长度：10300 bp,特点：数量多且平均分布；位于内含子中；共显现遗传；结果重复性高；引物问题,SSR 多态性,2.5 简单重复序列间区标记（inter-simple sequence repeat,ISSR）进行SSR反应需要知道两侧序列以设计引物，但大多数情况下这些序列并不知道
15、。为了解决这一问题，提出了ISSR标记。设计出各种能与SSR序列结合的PCR引物，这些引物的3端或5端加上24个随机核苷酸，通过PCR反应，对两个相距较近，方向相反的重复序列之间的DNA序列进行扩增。所扩增的inter SSR区域的多个条带通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或者琼脂糖凝胶电泳得以分辩，扩增带多为显性表现。,5锚定引物 3锚定引物 NNNN（CA）n（CA）n NN CACACACACACA GTGTGTGTGTGTGTGT GTGTGTGTGTGT CACACACACACACACA NN n（CA）（CA）n NNNN 3锚定引物 5锚定引物,3锚定引物的PCR产物5锚定引物的PCR产物,
16、2.6 表达序列标签标记（expressed sequence tag，EST）一个基因组的所有碱基中一般只有大约2的碱基来组成编码蛋白质的基因，因此测序基因组已不再是一种创建基因目录的有效途径。大量的实验证明，cDNA的大规模测序才是了解基因组的先驱。,EST标记技术的原理是将mRNA反转录成cDNA并克隆到载体构建成cDNA文库后，大规模随机挑选cDNA克隆，对其5端或3端进行一步法测序，一般长度为300500bp，平均长度为360120bp。所获得序列与基因数据库已知序列比较，从而获得对生物体生长发育、繁殖分化、遗传变异、衰老死亡等一系列生命过程认识的技术。EST标记技术也是一种相对简便
17、和快捷鉴定大批基因表达的技术。,EST来源于一定环境下一个组织总mRNA所构建的cDNA文库。每一个EST代表一个表达基因的部分转录片段。通过对EST序列的分析，从中可以获得大量的基因表达信息。EST标记分为两大类：（1）以分子杂交为基础的EST标记，使用EST本身为探针和经过不同限制性酶酶切的基因组DNA杂交可以产生这类标记；（2）以PCR为基础的EST标记，按照EST的序列设计引物对植物基因组特殊区域进行PCR扩增能够产生此类EST标记。,EST标记的产生过程及应用（1）cDNA文库的构建（2）序列分析：去掉载体序列得到EST序列比较找出已知、未知EST最后进行综合评价分析获得所需EST标
18、记（3）数据分析,cDNA文库,EST,公共数据库,基因表达谱分析,电脑克隆,全长cDNA克隆,RACE,2.6 扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)建立在RFLP和PCR基础上的标记方法。AFLP标记是用DNA限制性内切酶酶解具有相对性状的两个群体的DNA，然后对酶切产物进行选择性扩增，最后在形成的扩增产物中发现不同。这种不同就是与目的性状相连锁的AFLP标记。,AFLP原理,AFLP基本步骤是：（1）基因组DNA的提取和检测；（2）限制性内切酶酶切及连接；酶切时一般选择两种酶（一种识别6碱基，一种识别4碱基），酶切后将
19、酶切产物与人工接头连接（人工接头为人为设计的一段双链DNA，包括核心区和酶切区两部分，连接前也要酶切）。在实践中，这两步一般是同时在一起反应的。（3）设计引物进行扩增；设计的引物包括三部分：5端是与人工接头核心区互补的序列、与限制性酶互补序列、3端是带有选择性碱基的黏性末端。PCR扩增一般有两步：一是预扩增（只有一个选择性碱基）、二是选择性扩增（有两或三个选择性碱基）。（4）在测序胶上分开这些扩增产物并检测其多态性。,荧光标记全自动AFLP原理与方法,For ABI 377 DNA Sequencer and AFLP Kits,AFLP,3 果树分子标记研究现状RAPD：所有果树SSR：柑橘
20、类、柚类、果梅、柿ISSR：柑橘类、柚类、李、杏、杨梅、波萝、罗汉果AFLP：柑橘类、柚类、扁桃、苹果、海棠、荔枝、芒果、桃EST：柑橘类,4 DNA分子标记在果树方面的应用4.1 亲缘关系和遗传多样性的研究4.2 DNA 指纹的建立（1）新品种登记和品种鉴定，主要作为该品种的专有“代号”，保护新育成的品种及育种家的权益；（2）品种纯度和重复性检验；（3）品种分类研究根据各品种DNA 指纹的差异程度可判断品种间亲缘关系远近。,4.3 遗传图谱的构建 遗传图谱(genetic linkage map)是通过遗传重组交换结果进行连锁分析所得到的基因在染色体上相对位置的排列图。,4.4 基因定位4.
21、5 分子标记的辅助育种,5 DNA分子标记辅助选择育种技术 植物育种包括两方面的重要工作，首先是确定育种材料中是否存在有用的遗传变异，其次是采用有效的方法把目标基因转移到品种中。利用易于鉴定的遗传标记来辅助选择是提高选择效率和降低育种盲目性的常用手段。近二十年来迅速发展起来的DNA分子标记技术给育种提供了新的途径，这就是所谓的“分子标记辅助选择育种技术（marker-assisted selection，MAS）”。,但此处不包括利用分子标记进行优异种质的鉴定筛选、亲本的确定、遗传材料的鉴定和分析、亲本遗传多样性的分析和亲缘关系的分析等，而是指把分子标记技术应用于育种过程之中，通过分析与目的基
22、因紧密连锁的分子标记的基因型来进行育种，从而达到提高育种效率的目的。,5.1 生物性状及其分子标记方法5.1.1 生物性状及其类型 生物性状是生物体所表现的形态结构特征和生理生化特征。5.1.1.1 质量性状（qualitative character）质量性状是指分离群体中表现为不连续变异而显示质的差异的性状。植物的抗病性、抗虫性和某些抗逆性（抗盐、抗旱）等性状表现为质量性状遗传。质量性状一般具显隐性，在分离世代无法通过表型来识别目的基因的位点是否纯。在几对基因共同作用相同时，无法识别哪些基因在起作用。5.1.1.2 数量性状（quatitative character）数量性状是指分离群体
23、内表现为连续变异而不显示质的差异的性状。产量性状、成熟期、开花期、品质等性状属于数量性状遗传。数量性状易受外界环境条件影响，选择周期长，效果差。,5.1.2 质量性状的分子标记方法5.1.2.1 近等基因系（near isogenic,NIL）分析法 近等基因系是一组遗传背景相同或者相近，仅仅在个别染色体区段上有差异的标记体系，是一系列回交过程的产物。轮回亲本（受体）和非轮回亲本（供体）杂交得到轮回亲本的近等基因系。如果近等基因系与轮回亲本的标记基因型不同，而与非轮回亲本的标记基因型相同，那么该分子标记可能和目标基因连锁。,5.1.2.2 分离体分组混合分析（bulked segregatio
24、n analysis,BSA）法 BSA法的原理是将分离群体中的个体依据研究的目标性状（如抗病和染病）分成两组，在每组群体中把各个个体的DNA等量混合，形成两个DNA混合池。因此又称为近等基因池法。它克服了许多植物不易获得近等基因系的缺点。,5.1.3 数量性状的分子标记方法 数量性状的分子标记为研究数量性状的遗传基础提供了可能，控制数量性状的基因在基因组中的位置称为数量性状基因位点（quantitative trait locus，QTL）。QTL是指控制某一性状的所以基因的集合，在作物中往往与很多重要经济性状密切相关。利用分子标记进行遗传连锁分析以检测出数量性状基因位点叫做QTL定位（QT
25、L mapping）。,5.2 遗传连锁图谱的构建5.2.1 目的 MAS是通过在分子水平上分析与目标基因紧密连锁的分子标记的基因型来判别目标基因是否存在，并对目标基因进行间接选择的一种植物选择育种方法。其原理是利用与目标基因紧密连锁或表现共分离关系的分子标记对选择个体进行目标区域以及全基因组筛选，从而减少筛选过程，提高育种效率的目的。由于育种目的和材料不同，育种程序也就不同，进而MAS的具体方法也会不同，但不论哪种方法，都必须构建完整的分子标记连锁图谱，即遗传连锁图谱。,5.2.2 过程 五个步骤：（1）选择合适的分子标记；（2）选择用于建立作图群体的亲本组合；（3）建立作图分离群体；（4）
26、测定作图群体中不同个体或者株系的标记基因型；（5）对标记基因型数据进行连锁分析，构建标记连锁图。,5.3 DNA分子标记数据的处理与分析软件5.2.1 数据处理 原理：以电泳图谱中带的有无来表现。因为带的有无表示研究对象基因组中酶切位点或引物结合位点的有无及拷贝数的差异。方法：采用人工读带或自动图像分析系统读带的方法，有带的记为1，无带的记为0，把这些数据收集起来构成数据矩阵，输入不同的软件进行分析。5.2.2 常用软件 AMOVA（瑞士日内瓦大学）、PHYLIP（美国西雅图华盛顿大学）、MEGA（美国亚利桑那州立大学）、TREECON（比利时Antwerp大学）、RAPDistance（澳大利亚国立大学）、DIPLOMO（澳大利亚国立大学）、MAPMAKER、SPSS等。,
