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1、微生物保藏及基本操作技术,中国工业微生物菌种保藏管理中心 CICC姚粟 博士,微生物菌种保藏,菌种是进行微生物学研究和应用的基本材料，是发展生物工程的重要基础条件之一，是国家的重要生物资源。菌种保藏管理要求各保藏中心必须具有保藏菌种的详细历史及有关实验资料。并对其所负责保藏的菌种均应采取妥善、可靠的方法保藏，避免菌种的污染或死亡。中国微生物菌种保藏管理条例,微生物菌种保藏,制订专门菌种保藏管理制度；同一株菌种采用两种以上保藏方法保存；对只能采用一种保藏方法的菌株备份存放于两个以上的保藏设备中；对菌种的入库和出库记录入档，实行双人负责制管理；设专人负责管理菌种保藏设施正常运行，定期检修维护。,微
2、生物菌种保藏,微生物菌种保藏方法基本原理是在挑选优良纯培养物并使其处于休眠状态基础上，人为地创造一个有利于休眠的环境，使其长期保存后仍能保持菌种原有的优良特性。基本措施是低温、真空、干燥。,常用菌种保藏方法,定期移植法液体石蜡法真空冷冻干燥法-80低温冻结法液氮超低温冻结法,定期移植法,亦称传代培养保藏法，指将菌种接种于适宜的斜面培养基上，最适条件下培养，完成培养于46进行保存并间隔一定时间（3-6个月）进行移植培养的一种短期菌种保藏方法。操作步骤：斜面制备 接种 培养 保藏,接 种,定期移植法操作简单，使用方便；对设备和人员要求不高；可随时使用，便于观察菌种；工作劳动强度大，属短期保藏，保藏
3、成本高；菌种传代频繁，易退化、污染。,液体石蜡法,指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养好后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（46）干燥处进行保存的一种菌种保藏方法。,操作步骤：,液体石蜡预处理,斜面培养物制备,灌 注 石 蜡,保 藏,液体石蜡法操作简单，使用比较方便；对设备要求不高，对人员操作水平有一定要求；菌种易退化、污染。,真空冷冻干燥法,指将保藏的菌种细胞或孢子悬浮于保护剂中，经预冻后在真空条件下使水分升华，再经真空封存后保存的一种长期菌种保存方法。,安瓿管的准备清洗选用中性玻璃材质的安瓿管；2%盐酸浸泡810h，自来水冲洗至中性，蒸馏水冲洗23次；置于
4、烘箱中烘干。棉塞打棉塞，160定型2h；标签激光打印标签，标明菌株编号和保藏日期，大小约1020mm。喷码于安瓿管外，160固定20min。灭菌 121，30min.,保护剂的准备保护剂：12%脱脂牛奶蒸馏水溶液，25ml/管；灭菌锅加热至沸腾，将牛奶管放入锅中，113灭菌20min；打开放气阀缓慢排出蒸汽，取出灭菌后脱脂牛奶试管，迅速放入凉水中冷却；30培养2天，无菌检查合格后备用。,冻干样品制备制备斜面培养物；将保护剂用无菌吸管注入到斜面培养物上，用吸管刮取斜面上的菌体，使菌体均匀地悬浮在保护剂内。用长毛细滴管将菌悬液分装到安瓿管内，0.10.2ml/管，操作时要把带有菌悬液的长毛细滴管直
5、接插入安瓿管的底部，勿使菌液沾在管壁上。,真空干燥 在开动真空泵后应使真空度在15min内达到66.5Pa，随后逐渐达到26.613.3Pa，在此条件下，样品将保持冻结状态，其中水分则不断升华，干燥才能顺利地进行。终止干燥时间应根据下列情况判断：安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状真空度接近空载时的最高值样品温度与管外温度接近选用12支对照管，其水份与菌悬液同量，当其水分完全蒸发时视为干燥完结,预冻制备菌悬液、经分装到进行预冻之间的时间不宜超过1h；分装完成后将安瓿管立刻放入3540冰箱预冻1h，使菌液完全冻结；可采用分段式预冻，先将分装好的安瓿管置20冻30分钟，再放入80冰箱冻30min；采用
6、离心式冻干装置时勿需预冻。,熔封 将安瓿管的中上部用火焰烧软，拉成细颈；将安瓿管装到多歧管上，用火焰在细颈处熔封；拉管时注意火焰不要离菌体太近。,真空度检测 用高频电火花检查各安瓿管的真空情况，如管内呈现灰蓝光，说明真空度符合要求。,真空冷冻干燥法保藏、运输方便；保藏时间长(5 10年)；对设备要求高(真空冷冻干燥机、多歧管)，对人员操作水平要求高；冷冻干燥过程对菌体有损伤，需恢复培养。,-80冰箱冻结法,将菌种悬浮于保护剂中，在80冰箱中冻结保存的一种长期菌种保藏方法。,准备冷冻管,准备保护剂（10%-15%甘油）,准备菌悬液（细胞、孢子或芽孢悬液）,制备冷冻管（取菌悬液和保护剂至冷冻管）,
7、保藏（-80，25年）,-80冰箱冻结法使用方便；保藏时间较长；对设备要求高(-80冰箱)；运输不方便。,液氮超低温冻结法,指悬浮于保护剂中的菌种经程控降温后，移置于196的液氮或150左右的液氮气相中保存的一种长期菌种保藏方法。,操作步骤冷冻管准备保护剂制备保藏培养物准备预冻 将程序降温系统预冷到4，将制备好的冷冻管放入其中，以1/min降温速率降至-35；使用程序降温盒。保藏 将预冻后的冷冻管转移至液氮气相(-150)或液相(-196)。,同“80冰箱冻结法”,液氮超低温冻结法保藏时间长；保藏效果好，菌种不易退化；对设备要求高(程控降温仪、液氮罐)，对人员操作水平要求高；保藏成本高。,不同
8、保藏方法的比较,菌种保藏技术进展,程序降温控制技术,冻结速度对菌种细胞的影响,冷冻速度慢：细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积收缩。冷度速度快：细胞内水分没有足够时间外渗，细胞内结冰。冷冻速度非常快：细胞内冰晶非常小或称玻璃化状态。,原位低温保藏技术 有些菌种不可培养，也无法采用标准的冷冻干燥技术保藏，如一些致病菌、无法培养的菌种或者与其他微生物共生的菌种（如菌根真菌）等。这些菌种可采用原位低温保藏技术，这一技术已经被应用在一些锈菌种的保藏过程中。,Teliospores:Puccinia spp。Source:http:/doacs.state.fl.us/pi/enpp/pathology/i
9、mages/dayl.,菌种保藏技术进展,包埋固定化技术 是在藻酸钙颗粒或其他基质中进行的。含有藻酸钠的菌悬浮液加入氯化钙后会形成藻酸钙固定化细胞，细胞一旦固定化，便可采取传统的冻干保藏方法进行保藏。这种固定化技术已经被应用在真菌中，并延伸至线虫和藻类。,Mycelium radiating from an alginate bead on an agar plate.M.Ryan/Mycologist 15:66-69,菌种保藏技术进展,玻璃化技术 就是用极快的冷却速率，使细胞及其所处的溶液来不及形成冰晶，一下子以“非晶体”的方式固化下来，可以阻止冰晶体对细胞的破坏作用。对于1微米直径的纯净
10、水滴，只有当冷却速率高达107/秒时才能实现“玻璃化”。,菌种保藏技术进展,保藏菌株要求,药品微生物检验用的试验菌应来自认可的国内或国外菌种收藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株。,31,2010版中国药典药品微生物实验室规范指导原则,国内认可的菌种收藏机构,1979年7月，全国第一届菌种保藏管理会议正式成立中国菌种保藏管理委员会（CCCCM），委员会下设7个全国性菌种保藏管理中心及机构所在地：普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）,中国科学院微生物研究所农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）,中国农科院区划所工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），中国食品发酵工
11、业研究院医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC），中国药品生物制品鉴定所抗菌素菌种保藏管理中心（CACC），中国医科院医用生物技术研究所兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC），农业部兽医药品监察所林业微生物菌种保藏管理中心（CFCC），中国林业科学院,国认外可的菌种收藏机构,世界菌种保藏联合会WFCC(World Federation Of Culture Collection)全球注册的菌种保藏机构583家ATCCNRRLDSMZNCTCCMICBSNBRC(IFO)JCM,菌株代数,美国药典（USP）中规定：“将微生物接种至一新鲜培养基上/内，每萌发一次即称为一代，”并规定“菌种的传代次数（
12、自原始菌种冻干粉起）不得超过5代”。United States Pharmacopoeia(USP)provides that:to microbial inoculation to a fresh medium on/in each germination time is referred to as a generation,and provides that strains of the passages(from the original strain from freeze-dried powder)must not exceed 5 generation.“我国的GMP认证中也如此
13、要求，并且中国药典2005年版药典也已做出“菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代”这个明确的规定。Chinas GMP certification is asking,and the Chinese Pharmacopoeia 2005 edition of Pharmacopoeia also had a strain of the passages(from the original strain from freeze-dried powder)should not exceed 5 on behalf of The clearly defined.,Enrichment(G
14、1),Separation of single-olony(G2),Working strain(W3),Working strain(W4),Working strain(W5),标准菌株提供形式,Accuracy,Easy of Use(preparation),High,Low,Complicated,Easy,Quanti Cult(REMEL),Standard Strains(ATCC/NBRC etc.),EZ-CFU one step(MicroBioLogics),KWIK-STIK(MicroBioLogics),Culti Loops(REMEL),BioBall(BTF/bioMerieux),参考菌株,Primary strain,Qualitative strain,Quantitative strain,
