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1、实验四 培养基的制备和消毒灭菌,明确培养基的配置原理；掌握配制培养基的一般方法和步骤；了解高压蒸气灭菌的基本原理、应用范围及高压蒸气灭菌的操作方法；学习棉塞的制作等基本操作技术。,目的要求：,基本原理：培养基中含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量的琼脂作为凝固剂，琼脂在96时溶化，40时凝固，通常不被微生物分解利用。,一、牛肉膏蛋白胨培养基的制备,牛肉膏蛋白胨培养基的配方,牛肉膏 3.0g 蛋白胨 10.0 g NaCl 5.0 g 琼脂 20.0 g 水 1000 m
2、l pH 7.47.6,实验器材,溶液或试剂 牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，lmol/L NaOH lmol/L HCl。仪器或其他用具 试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸，棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。,操作步骤,1称量 按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。2溶化 在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后在石棉网上加热使其溶解。,在未调 pH前，先用 pH试纸测量培养基的原始 pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入 lmolL NaOH，边加边搅拌，并随时用 pH试纸测其pH，直至pH达7.6。反之，用
3、lmolL HCl进行调节。,3调pH,4过滤,用滤纸或多层纱布过滤。一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去（本实验勿需过滤）。5分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装试管，其装量不超过管高的15，灭菌后制成斜面。,6加塞,在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进人培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。7包扎 在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用绳子扎好。注明培养基名称、组别、配制日期。,8灭菌,将上述培养基以 0.103 MPa 121，20min高压蒸气灭菌。,二、马丁氏培养基的制备,基本原理：是一种用来分离真菌的选择性培养基
4、。此培养基是由葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO47H2O、孟加拉红和链霉素等组成。其中葡萄糖作为碳源，蛋白胨作为氮源，KH2PO4、MgSO47H2O作为无机盐，为微生物提供钾、磷、镁离子。这种培养基的特点是培养基中加人的孟加拉红和链霉素能有效的抑制细菌和放线菌的生长，而对真菌无抑制作用，因而真菌在这种培养基上可以得到优势生长，从而达到分离真菌的目的。,马丁氏培养基的配方,KH2PO4 1gMgSO47H2O 0.5g蛋白胨 5 g葡萄糖 10 g琼脂 1520 g水 1000 mlpH 自然临用时以无菌操作在 100 ml培养基中加入 l的链霉素0.3 ml，使其终浓度为 30g/ml
5、。,实验器材,溶液或试剂 KH2PO4，MgSO47H2O，蛋 白胨，葡萄糖，琼脂，链霉素（1水溶液）。仪器或其他用具 试管，三角烧瓶，烧 杯，量筒，玻棒，天平，牛角匙，高蒸气灭菌锅等。,操作步骤,称量 溶化 加塞 包扎 灭菌,三、高压蒸气灭菌,基本原理：高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加热灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。,在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除
6、是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。,实验器材,牛肉膏蛋白胨培养基马丁氏培养基培养皿、试管、三角瓶、移液管手提式高压蒸气灭菌锅等。,操作步骤,1.将内层锅取出，再向外层锅内加入适量 的水，使水面与三角搁架相平为宜。2.放回内层锅，并装入待灭菌物品。3.加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅 的排气槽内。再以两两对称的方式同时 旋紧相对的两个螺栓。,4.用煤气加热，待冷空气完全排尽后，关上排气阀。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用0.1Mpa，121.5，20min灭菌。5.灭菌所需的时间到后，关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表降至“0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。,每组准备下列物品（灭菌）：,1.培养基一瓶（500ml三角瓶，内装200ml培养基）2.无菌水一瓶（250ml三角瓶，内装90ml水）3.试管6支（内装9ml水）4.培养皿一包（9个）5.移液管6支6.玻璃刮刀一个,
