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1、,第六章,微生物生长繁殖与遗传变异,重点内容提示：细菌等单细胞微生物的生长繁殖规律，在废水处理等实际应用中的指导意义。细菌等微生物遗传变异的原理，利用微生物的变异性改变微生物菌种性能的途径与方法。,1.微生物的生长繁殖及其特性,几个概念 生长：个体增大，细胞组分与结构在量方面 的增加；繁殖：个体数量增多。,单细胞生物与多细胞生物生长与繁殖的差异？单细胞由于细胞分裂引起个体数目的增加；多细胞通过无性或有性孢子使个体数目增加的过程。,幼龄菌：指代谢速度快，生长繁殖旺盛的菌体。（对数生长期）老龄菌：指代谢缓慢，生长繁殖能力低下的菌体。（衰老期）,显微镜直接计数,计数器计数,比例计数法,间接法,平板菌
2、落计数法（活菌计数法）,液体计数法（统计学原理）,重量法,细胞重量法：湿重与干重,细胞含氮量,DNA含量,试比较各方法优缺点，适用范围？,微生物生长繁殖的测定方法,比浊法(悬浮细胞浓度),比例计数法,已知霉菌孢子密度为8108个/ml，根据显微镜视野中比例细菌密度为1108个/ml优点：测定过程快速；缺点：不能区分微生物的死活，且不太精确。不适用于丝状菌体,在计数区滴加菌液，盖上特制盖玻片，利用毛细作用让菌液充满计数区,细菌计数区面积为1mm2，划分为25个大方格，每个大方格又分为16个小格，计数区的深度为0.02mm。则每个大方格的体积是1/1250000ml，（1/25mm20.02mm）
3、。,计数时使用油镜，一般数5个大方格的菌数后计算每个大方格的平均菌数。如图所示，大方格中有14个细菌,用每个大方格的平均菌数1250000，即为每ml菌液含菌数。,Peteroff-Hausser计菌器计数法,优点：直观、快速、操作简单；缺点：不能区分微生物的死活，不能计数运动强的活菌。不适用于丝状菌体。,。,菌落形成单位（colony-forming unit，CFU）,平板菌落计数法,优点：活菌计数，不含死的微生物细胞；缺点：测定所需时间长，操作繁琐，要求技术熟练。不适用于严格厌氧菌的培养。,快速计数滤纸片,TTC（氯化三苯基四氮唑，无色）TF（三苯基甲臜，红色）,滤膜法,优点：活菌计数，
4、不含死的微生物细胞；缺点：测定所需时间长，要求样品中不含有过多的悬浮性固体。适用于微生物含量比较低的样品测定。,液体稀释法（MPN法）,最大可能数量表（most probable number，MPN）,主要用于不能在平板培养基上形成菌落的微生物。,比浊法（Turbidity measurement）,单细胞微生物生长繁殖规律,生长曲线（growth curve）如何获得？根据测定生物量的方法不同，生长曲线分有：重量法、数量法、浓度法等。,细胞重量,生长率上升阶段：细胞适应环境后快速生长繁殖的阶段，增代时间最短。细胞重量迅速增加。生长率下降阶段：指生长繁殖速率下降（减缓）的阶段。内源呼吸阶段：
5、利用细胞内物质维持生命，细胞重量减 少。细胞代谢缓慢，趋向衰老死亡。,细胞数量法（缓慢、对数、稳定和衰亡期）,迟缓期,衰亡期,稳定期,对数期,总菌数,活菌数,试分析细胞数量法曲线各阶段的特点：缓慢期（适应期）:细胞不繁殖。但酶活跃，细胞物质增多，为繁殖作准备。产生迟缓期的原因，是微生物接种到一个新的环境，暂时缺乏足够的能量和必需的生长因子，“种子”老化(即处于非对数生长期)或未充分活化，接种时造成的损伤等。影响因素:菌种特性接种龄接种量培养基成分,对数生长期:所有细胞的生长繁殖速率以几何级数（2n）的方式分裂，生长速率最快，世代时间G或倍增时间最短，细菌内各成分按比例有规律地增加，细菌的代谢活
6、性、酶活性高而稳定，生活力强。关于G（世代时间）：X2=X12n,式中：n为繁殖代数;R为生长速率常数；,影响因素：菌种特性营养成分营养物浓度培养温度,培养温度的影响,稳定期：菌体产量达到最高点，新增长细胞数与死亡细胞量基本相等（R=0).由于营养物质消耗，代谢产物积累和 pH 等环境变化，逐步不适宜于细菌生长，导致生长速率降低直至零，结束对数生长期，进入稳定生长期。衰亡期：死细胞多于活细胞，内源呼吸阶段。营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率逐步增加和活细菌逐步减少.,曲线在实践中指导意义 如菌种保藏（乳酸杆菌、解酚细菌等）发酵工业菌扩培及发酵接种 收获微生物细胞及发酵产品 废水
7、处理 单细胞微生物在这些应用实践中宜采用哪一阶段的生理菌？,生长阶段与污水生物处理指数期（生长率上升阶段）优点：细菌代谢速度最快，净化有机物的效率最高。缺点：菌体不易凝聚沉淀；净化后有机物浓度不能达到 排放标准；微生物污泥量大。,稳定期（生长率下降阶段）优点：菌体沉降性能较好，处理有机物较为彻底。缺点：污泥量较大。,衰亡期（内源呼吸阶段）优点：有机物完全氧化，细胞沉降性能与出水水质好，污泥量小。缺点；净化效率慢，有机物质浓度低。,连续培养,也称开放培养（open culture）具体操作：细胞培养对数期后，以一定速率流入新鲜培养基，并利用溢流方式以同样流速流出培养物。容器内培养物达到动态平衡，
8、微生物生长维持在某一对数生长期的生长速率。,恒浊器（培养液流速不稳定）恒浊器中菌体密度较稳定，菌体以最高生长速率生长。应用上：获得大量菌体生长相平衡的代谢产物（如乳酸、乙醇等）都可以用恒浊器进行连续发酵。恒化器（培养液流速不变）微生物在低于最高生长速率的条件下生长繁殖，应用上：主要用于科学研究工作，如限定底物浓度研究微生物的生长速率等。,连续培养的优点：,高效节约了大量动力、人力、水和蒸汽自控产品质量较稳定,连续培养的缺点：菌种易于退化易遭杂菌污染营养物的利用率低,2.微生物的遗传变异,遗传变异概念与特性 正变：优良性状提高.如生产菌发酵周期缩短，产量提高；菌种降解物质能力增强等。负变：应用功
9、能下降.如生产菌发酵力退化，病原菌致病性增强，菌种降解物质能力下降。变异株易发现：从形态、细胞结构（芽孢、荚膜等）以及生理代谢特性等方面辨别与判断。微生物遗传保守程度：其大小由不同菌种决定。,细菌等微生物遗传的物质基础 遗传物质确定过程：1928年，英国细菌学家格里菲斯（Griffth）研究两种肺炎双球菌型的毒性。,1928年，Griffith进行了以下几组实验：（1）动物实验对小鼠注射活RII菌或死SIII菌 小鼠存活对小鼠注射活SIII菌小鼠死亡对小鼠注射活RII菌和热死SIII菌 小鼠死亡抽取心血 分离活的SIII菌,研究对象：Streptococcus pneumoniae（肺炎双球菌
10、）SIII型菌株：有荚膜，菌落表面光滑，有致病性RII型菌株：无荚膜，菌落表面粗糙，无致病性,（一）经典转化实验（transformation）：F.Griffith,Griffith转化试验示意,混合培养,RII型活菌,SIII型活菌,SIII型热死菌,RII型活菌,SIII型活菌,健康,健康,健康,健康,健康,健康,健康,病死,病死,病死,（2）细菌培养实验,（3）S型菌的无细胞抽提液试验,以上实验说明：加热杀死的SIII型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入RII型细胞并使RII型细胞获得稳定的遗传性状，转变为SIII型细胞。,热死SIII菌不生长活 RII 菌长出RII
11、菌热死SIII菌长出大量RII菌和10-6SIII菌,活R菌+S菌无细胞抽提液长出大量R菌和少量S菌,+活RII菌,平皿培养,1944年，O.T.Avery(埃弗里)等从热死的S型肺炎双球菌中提纯了各种成分（DNA,蛋白质，荚膜多糖等），并在离体条件下分别实验。结果发现S型肺炎双球菌的DNA具有使R型细胞产生毒性、小白鼠死亡的能力。,DNA组成与构成,胸腺嘧啶thymine,核酸成分：碱基(嘧啶、嘌呤），戊糖，磷酸。,胞嘧啶cytosine,尿嘧啶uracil（存在于RNA中）,鸟嘌呤guanine,腺嘌呤Adenine,戊糖,两种戊糖:DNA所含的糖为-D-2-脱氧核糖；RNA所含的糖为-D
12、-核糖。,糖与碱基构成核苷(nucleoside),糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键。,磷酸与核苷构成核苷酸,核苷酸是核苷的磷酸酯。作为DNA或RNA结构单元的核苷酸分别是5-磷酸-脱氧核糖核苷和5-磷酸-核糖核苷。,1953年，DNA的结构通过x射线观察，确定是两条走向相反的多核苷酸链构成的双螺旋结构。在这种结构中，A-T、G-C之间以氢键等方式连接。,微生物细胞中的核酸,多数双链DNA，少数单链DNA。少数病毒遗传物质为RNA。原核微生物除细胞核区外，在细胞质中还存在携带少量基因的环状DNA片段（质粒）。真核微生物的细胞核是DNA与蛋白质结合，存在于细胞核的染色体上。,核糖核酸（R
13、NA）,RNA分子量比DNA小，主要负责DNA遗传信息的 传递与翻译表达等。RNA为单链分子，根据RNA的功能，可以分为mRNA、tRNA和rRNA三种。,mRNA(信使RNA)Messenger RNA,mRNA约占总RNA的5%，不同细胞mRNA链长和分子量差异大功能：将DNA的遗传信息传递到蛋白质合成基地 核 糖核蛋白体上。如DNA一条链上的碱基：A T G C G T T C C A C 转录成mRNA的碱基：U A C G C A A G G U G 遗传密码:mRNA分子上三个碱基（三联密码）决定一个 氨基酸。,tRNA(转移RNA),约占总RNA的10-15%。它在蛋白质生物合成
14、中识别氨基酸的密码，并将相应的氨基酸转运到核糖核蛋白体上。rRNA(核糖体RNA)约占全部RNA的80%，是核糖核蛋白体的主要组成部分。rRNA 的功能是与蛋白质生物合成相关。,基因与性状,基因：DNA分子上代表一个遗传功能的片断。结构基因：决定蛋白质结构的DNA片断。调节基因：控制结构基因活动的DNA片断。操纵基因：与结构基因一起，起“开关”作用。,lacZ,lacY,lacA,性状：表观现象,生物合成蛋白质，以DNA为模板转录成mRNA，后tRNA根据mRNA三联体密码的信号将氨基酸进行运送，在核糖体上完成蛋白质的合成。,微生物变异主要是由基因突变和基因重组造成的。基因突变包含了自发突变和
15、诱发突变两类。自发突变:微生物自发突变频率为10-410-6。诱发突变:用物理、化学因素使微生物遗传信息改变，从而得到新的表观现象。常用的诱变剂：紫外线、x-射线等，亚硝酸、硫酸二乙酯、过氧化氢等化学试剂。,细菌等微生物的变异,点突变,碱基置换（转换、颠换）,移码突变,DNA分子中缺失或增加少数几个碱基对而引起,造成突变点以后全部遗传密码转录与转释发生错误,增添一个碱基,缺少一个碱基,基因重组（Gene recombination）,基因重组（或遗传重组）：两个不同性状的个体（供体、受体）内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式。原核微生物的基因重组：转化、转导
16、、接合、原生质体融合等。真核微生物的基因重组：有性杂交、准性杂交、转化、原生质体融合等。,几个基本概念,。,转化（Transformation）,转导（Transduction）,。,接合（Conjugation between different bacteria）,。,原生质体融合操作示意图,去壁 A+B-（高渗下）A+B-PEG或电脉冲 离心促融 去壁 A-B+（高渗下）A-B+融合子（AA,BB,AB）长成菌落 检出A+B+融合子 筛选优良性状的融合子,影印接种,-,基因工程及应用什么是基因工程？例：固氮基因转移到其他作物、蚕产丝蛋白基因引入细菌细胞；及人胰岛素、动物生长激素基因工程菌
17、等。环境工程中，降解石油的超级细菌（70年代，美国）；耐汞的质粒（日本、瑞典）与降解染料的质粒（1983，瑞士）；以及具有降解多种污染物功能的超级工程菌种等。,.降解石油的工程细菌 70年代美国生物学家(Chakrabarty)针对海洋输油，造成浮油污染，影响海洋生态等问题进行了研究。海水含盐量高，他发现90多种菌有不同程度降解烃类能力，但难在海水中大量繁殖，且降解速率较慢。他将能降解脂(含质粒A)的一种假单胞菌作受体细菌，分别将能降解芳烃(质粒B)、芳烃(质粒C)和多环芳烃(质粒D)的质粒，用遗传工程方法人工转入受体细菌，获得多质粒“超级细菌”，可除去原油中23的烃。浮油一般条件下降解需一年
18、多时间，而用“超级细菌”只需几小时即可把浮油去除。速度快效率高。,.耐汞工程菌 日本水俣事件及瑞典鸟类汞中毒事件后，日本和瑞典对汞在自然界转化做了大量研究工作，提出了汞化合物转化的途径，主要是某些微生物使水体汞元素甲基化形成甲基汞，使人及生物中毒。自然界中存在一些耐汞的微生物，它们的耐汞基因在质粒R因子上。例如，恶臭假单胞菌一般在超过2ugml汞浓度即将中毒死，查克拉巴蒂用质粒转移技术，把嗜油假单胞菌的耐汞质粒(MER质粒)转移到恶臭假单胞菌中去，后者获得MER质粒，可在5070ugml氯化汞中生长。脱色工程菌的构建 将分别含有降解偶氮染料质粒的偏号Kx和Kd两株假单胞菌通过质粒转移技术培育出兼有分解两种偶氮染料功能的脱色工程菌。,菌种保藏,五种常用保藏方法的比较,
