微生物的生长第5章新.ppt

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1、1,第5章 微生物的生长5.1微生物的生长及其特性5.2微生物的生存因子5.3其他不利环境因子 对微生物的影响,2,5.1.1 生长与繁殖的概念,何谓生长？同化作用大于异化作用时，细胞质的量增加，表现在细胞体积或重量的不断增加，这种现象称生长,何谓繁殖？生长一定程度后细胞分裂，这就是细菌的繁殖,5.1微生物的生长及其特性,3,1 单细胞微生物,生长：细胞物质增加，体积增大,繁殖：细胞数目的增加,生长：细胞物质增加，体积增大，细胞数目增加,繁殖：生命个体数目的增加,5.1.1 生长与繁殖的概念,2 多细胞微生物,4,个体的生长和繁殖体现为群体的生长（微生物重量或数目的增加）群体生长个体生长个体繁

2、殖,在微生物学中“只有群体的重复”才更有意义，因此“生长”一般指群体生长,5,1、间歇培养（Batch cultivation）和生长曲线（growth curve）,间歇培养：将一定量细菌接种于封闭的、一定量的液体培养基内，在一定条件下培养。培养过程不投加或取出任何东西。这种培养方式也叫分批培养。,生长曲线：细胞量随时间的变化曲线称生长曲线,5.1.2 细菌的生长特性,6,总细胞数,细菌的典型生长曲线：以时间为横坐标，以细菌数为纵坐标，做出一条菌数随时间变化的曲线，即为生长曲线,7,细菌生长曲线（按细菌数目的对数绘制）,8,9,停滞期、适应期（lag phase）,影响停滞期长短的因素：接种

3、龄：种子(inoculum)处于什么生长期、接种量：即初期微生物浓度与基质浓度的比 培养基成分：,特点：生长速率常数近于零，数目变化不大 细胞形态变大 rRNA含量增高 合成代谢较活跃,10,产生停滞期的原因：缺乏分解有关基质的酶 缺乏充足的代谢中间产物,停滞期、适应期（lag phase）,11,2）指数期（exponential phase）对数期（stationary phase）,细胞数(量)以指数形式增加的时间段 特点：生长速率最大,世代时间（generation time）倍加时间（doubling time）酶系活跃、代谢旺盛细胞进行平衡生长，体内各成分最为均匀,教学实验和发酵工

4、业都用对数期 的细胞做实验材料,或“种子”,12,代时(generation time):细胞数目增长1倍所需时间,Nt=2n No No 起始细胞数 Ntt时细胞数 n 世代数 lg Nt=lgNo+n lg2 n=(lg Nt-lgNo)/lg2k=n/t 平均生长速度：世代数/小时 g=t/n 平均代时(繁殖一代所需时间）,指数期的数学描述,13,某些微生物的代时,细 菌：大 肠 杆 菌 40C 0.35h 枯草芽孢杆菌 40C 0.43h藻 类：蛋白核小球藻 25C 7.75h原生动物：尾状核草履虫 26C 10.4h真 菌:酿 酒 酵 母 30C 2h,14,3）稳定期（statio

5、nary phase）：恒定期、最高生长期、生长下降期,特点：净增长速度为零,繁殖与死亡速度相等,正生长与负生长相等,出现稳定期的原因：,营养物尤其是生长因子耗尽 营养物比例失调 代谢物的积累 pH、DO、氧化还原电位的变化,15,4）衰亡期（decline phase,death phase）,内源呼吸期（endogenous respiration phase）,内源呼吸:体内贮藏物质酶等一部分细胞物质的氧化,出现死亡期的原因：,营养物不足（代谢产物的积累）外界条件恶化,16,5.1.3 生长研究微生物生长的方法,1 同步培养,是使群体细胞能处于同一生长阶段，并同时进行分裂的生长方式,是将

6、一定量的微生物接种在一个封闭的、盛有一定量液体培养基的容器中，不补加新营养物质,不排出产物,保持一定的温度、PH和溶解氧，微生物在其中生长,也叫间歇培养,2 分批培养,17,5.1.3 生长研究微生物生长的方法,3 连续培养,在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法,恒化器：营养物质浓度恒定恒浊器：光电系统控制培养中菌体浓度恒定,18,连续培养示意装置图,19,连续培养的稀释率,例:20ml/h 的流速连续培养,培养液体积1000ml,求稀释率:D=20ml/h 1000ml=0.02/h,稀释率：D=f/v,F培养基流速（ml/h）

7、V 培养液体积（ml）,20,连续培养广泛用于,酵母菌的生产(含糖废液)乙醇发酵(糖蜜)乳酸发酵石油脱腊污水处理,21,菌种退化、设备要求高、原料利用略低、回用问题,连续培养优点与缺点,优点:,简化了装料、灭菌（节省动力）、清洗等（蒸汽、人力）单元操作；,减少非生产时间；提高设备利用率；,便于自动控制,产品质量稳定,缺点：,22,（活性污泥等的混合微生物群，也有类似的生长曲线),水处理中如何避免延滞期,微生物维持到对数期可获得高的处理能力，即分解速度，但处理效果 不一定好,5.1.4 细菌的生长曲线与废水的生物处理,23,处于稳定期污泥虽然生长速度有所下降，但有一定的代谢活性，絮凝沉降性能好。

8、故传统的活性污泥法常运行在这个范围,衰亡期只出现在某些特殊的水处理场合 如延时曝气及污泥消化,24,食料/微生物,代谢速率,内源呼吸阶段,生长率下降阶段,生长率上升阶段,（沉降性能好）,（沉降性能差）,大多数活性污泥处理系统运行范围,延时曝气，污泥消化,微生物代谢速率与食料/微生物的关系,25,此法通常用来测定样品中所含细菌、孢子、酵母菌等单细胞微生物的数量。计数法又分为直接计数和间接计数两类。,1、计数法,5.1.5 微生物生长量的测定方法,26,这类方法是利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。此法的缺点不能区分死菌与活菌,直 接 计 数,每毫升原液

9、所含细菌数每小格平均细菌数400l000稀释倍数,1、计数法,27,28,29,此法又称活菌计数法，其原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落,间 接 计 数,每毫升原菌液活菌数同一稀释度三个以上重复平皿菌落平均数稀释倍数,1、计数法,30,31,例:稀释度 10-6/ml,形成150个菌落,即1.5 x 108/ml,细胞凝聚不能有效地分散,平板计数：,稀释样品,涂于平板表面,通过计算菌落数即可知道样品中活菌数.,实验要求稀释度:30-300 个菌落/皿,平板计数得到结果称为菌落形成单位CFU(colony forming unit),下列因素导致计数偏低,不能保

10、证每个菌落来源于一个细胞,32,然后再把膜放到具有培养液的垫上或培养基上,滤 膜 培 养：,膜过滤,截流细菌,培养一定时间计算菌落,33,实 验 过 程,0.5 um,34,滤 膜 培 养,应用特定的培养基,可得到选择的微生物,粪便大肠杆菌培养基,麦芽汁琼脂 长出酵母和霉菌,远藤氏琼脂,普通培养基,35,DNA含量,此法的原理是根据每个细胞有一定的重量而设计的。它可以用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长的测定,微生物湿重,微生物干重,蛋白质总量,2、重量法,36,蛋白质总量含氮量6.25蛋 白 质 总 量 细胞总量蛋白质总量(50%80%(或65%)蛋白质总量1.54D N A 含 量 核酸

11、DNA是微生物的重要遗传物质，每个细菌的DNA含量相当恒定，平均为8.410-5ng.,37,5.2 微生物的生存因子,温度对微生物生长的影响：酶的活性；细胞膜的流动性；物质的溶解度,微生物对温度变化很敏感,高过极限导致死亡：酶、运输载体被破坏，膜崩解；低温：功能受到影响，但化学组分和结构不一定全受到影响,5.2.1 温度,38,微生物有各自的最低、最适和最高生长温度范围,据微生物对温度的生长需求，将微生物分四大类，嗜冷菌、嗜中温菌、嗜热菌和嗜超热菌,5.2.1 温度,基本温度 cardinal temperature：,最低温度最适温度最高温度,39,一种生活在蚊子消化道内的原生动物，22-

12、27C在简单培养基中就可以生长,但在33-34C下,必须向培养基中加金属、氨基酸、维生素才能生长。,一种微生物三个基本温度并非不变，依赖于其他因素：,5.2.1 温度,40,温度对生长速度影响,最适温度靠近最高温度,而非最低温度,41,微生物生长温度范围举例,42,五种类型微生物生长温度和最适温度,43,嗜 冷 菌 psychrophile,来源：海洋 近年来在南极洲发现古生菌产甲烷菌,基本特征：,0oC可生长,最适生长温度等于、低于15C,最高生长温度20C,细胞膜含有大量的不饱和脂肪酸,44,兼 性 嗜 冷 菌 pschrotroph,0-7C 生长最适生长温度 20-30C最高生长温度

13、35C污染冷冻食品,基本特征：,45,嗜 温 菌 mesophile,最低生长温度 15-20C 生长最适生长温度 20-45C最高生长温度 约45C,基 本 特 征：,大多数微生物属于这个范围，人类致病菌都是嗜温菌，宿主环境37C,46,嗜 热 菌 thermophile,具有高温下发挥功能的热稳定酶和蛋白质合成系统，细胞膜脂类物质饱和度高（相比嗜温菌）,基本特征：,最低生长温度 约45C 生长最适生长温度 55-65C最高生长温度 70C堆肥、自我升温的干草堆、热水管道、温泉等处生长,47,超 嗜 热 菌 hyperthermophile,低于55C通常不能生长少数能在90C以上温度生长；

14、80-113C下生长的原始生物成为超嗜热菌,基本特征：,48,100C 以上温度条件下的微生物,有证据表明，113 C 下生长繁殖；很可能在更高的温度下生长繁殖；265p/460C 海水不沸腾超嗜热菌研究科学和应用价值极大,49,细 菌：中性或偏碱性 放 线 菌：中性偏碱性酵母菌霉菌：酸性污水净化处理：瀑气池pH 6.58.5有机固体废物：pH 58,嗜 酸 菌 acidophile pH 0-5.5 嗜中性菌 neutrophile 嗜 碱 菌 alkalophile,每种微生物都有其生长pH 范围和最适pH,5.2.2 pH,50,一般好氧微生物：0.30.4伏，0.1伏兼性厌氧：0.1伏

15、，好氧；0.1伏，厌氧专性厌氧：-0.2-0.25伏，产甲烷菌：-0.3-0.4伏影响因素：氧分压 环境中的pH 可用一些还原剂控制,5.2.3 氧化还原电位,51,1 专性好氧微生物:氧分压为0.2个大气压2 微量好氧微生物:氧分压为0.003-0.2个大气压3 耐氧厌氧微生物：4 兼性厌氧微生物：5 厌氧微生物：氧分压小于0.005个大气压,5.2.4 溶解氧,5.2.5 太阳辐射,5.2.6 水的活度与渗透压,5.2.7 表面张力,52,5.3 其它不利因素对微生物影响,（2）电离辐射：能使被照射的物质产生电离作用,1 紫外辐射和电离辐射,（1）紫外辐射,以260nm左右紫外线的杀菌力最

16、强 杀菌机理是作用核酸 穿透力差 光复活现象,辐射机理引起水分子的分解,5.3.1 物理因素,53,极端高度：杀死微生物 极端低温：抑制微生物生长 应 用：高温杀菌,2 超声波：频率大于20,000赫兹，人耳听不见,具有强烈的生物学作用，几乎所有的细菌都能被超声波破坏 杀菌机理应用,3 极端温度:超高温、超低温,主指超高温的影响,4 干 燥,54,1 重金属2 极端 pH3 若干有机物 醇、醛和表面活性剂4 抗生素对微生物的影响,5.3.2 化学因素对微生物的影响,55,微生物的分离和纯培养(供实验课)无菌技术用固体培养基分离纯培养用液体培养基分离纯培养单细胞(单孢子)分离选择培养分离二元培养

17、物微生物的保藏技术,56,无菌技术微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且无处不在。因此，在微生物的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术被称为无菌技术(aseptic technique)，它是保证微生物学研究正常进行的关键。,57,微生物培养的常用器具及其灭菌试管、玻璃烧瓶、平皿(culture dish，petri dish)等是最为常用的培养微生物的器具，在使用前必须先行灭菌，使容器中不含任何生物。培养微生物的营养物质称为

18、培养基(culture medium)可以加到器皿中后一起灭菌，也可在单独灭菌后加到无菌的器具中。,58,最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌,59,为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。平皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。,60,接种操作用接种环或接种针分离微生物，或在无菌条件下把微生物由一个培养

19、器皿转接到另一个培养容器进行培养，是微生物学研究中最常用的基本操作。由于打开器皿就可能引起器皿内部被环境中的其他微生物污染，因此微生物实验的所有操作均应在无菌条件下进行，其要点是在火焰附近进行熟练的无菌操作，或在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行操作,61,用固体培养基分离纯培养 不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌，以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养,62,所谓平板，即培养平板(culture plate)的简称，它是指熔化的固体培养基倒入无菌平

20、皿，冷却凝固后，盛有固体培养基的平皿。固体培养方法可将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。,63,固体培养基(用琼脂或其他凝胶物质固化的培养基)，可使每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。Koch建立的平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。,64,稀释倒平板法(pour plate method)涂布平板法(spread plate method)平板划线分离法(streak plate method)稀释摇管法(dilution shake culture met

21、hod),65,稀释倒平板法待分离的材料用无菌水作一系列的稀释，取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间，可能出现在平板表面或琼脂培养基中的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。,66,涂布平板法 在微生物学研究中更常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒人无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落

22、。,67,68,69,平板划线分离法 用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。,70,71,72,73,74,稀释摇管法 对于那些对氧气更为敏感的厌氧性微生物，纯培养的分离则可采用稀释摇管培养法进行。将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后，冷却并保持在50左右，用这些试管进行梯度稀释待分离材料，试管均匀，冷凝，倾注一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和空气隔开。培养后，菌落形成在琼脂柱的中间，挑

23、取和移植单菌落。,75,76,用液体培养基分离纯培养 接种物在液体培养基中依序稀释，以达高度稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物。如果稀释后的多数试管中没有微生物生长，则有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。采用稀释法进行液体分离，必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数(一般应超过95%)表现为不生长。,77,单细胞(单孢子)分离 采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为单细胞(单孢子)分离法。单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比，较大的微生物如藻类、原生动物较容易，个体很小的细菌则较难。单细胞分离法对操作技术有比较高的要求，多限

24、于高度专业化的科学研究中采用。,78,选择培养分离如果某种微生物的生长需要是已知的，也可以设计一套特定环境使之特别适合这种微生物的生长，因而能够从自然界混杂的微生物群体中把这种微生物选择培养出来，即使在混杂的微生物群体中这种微生物可能只占少数。这种通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离。可利用选择培养基进行直接分离或富集培养。,79,利用选择培养基进行直接分离主要根据待分离微生物的特点选择不同的培养条件,得到纯培养物。富集培养主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界

25、中分离到所需的特定微生物。富集条件可据分离的微生物的特点从物理、化学、生物及综合多个方面进行选择，如温度、pH、紫外线、高压、光照、氧气、营养等等许多方面。,80,二元培养物 只有一种微生物的培养物称为纯培养物，含有二种以上微生物的培养物称为混合培养物，而如果培养物中只含有二种微生物，而且是有意识地保持二者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。例如二元培养物是保存病毒的最有效途径。对于这些生物，二元培养物是在实验室控制条件下可能达到的最接近于纯培养的培养方法。,81,微生物的保藏技术传代培养保藏冷冻保藏干燥保藏法,82,通过分离纯化得到的微生物纯培养物，必须通过各种保藏技术使其在一定时间内不死

26、亡，不会被其他微生物污染，不会因发生变异而丢失重要的生物学性状，否则就无法真正保证微生物研究和应用工作的顺利进行。菌种或培养物保藏是一项最重要的微生物学基础工作，微生物菌种是珍贵的自然资源，具有重要意义。,83,菌种保藏就是根据菌种特性及保藏目的的不同，给微生物菌株以特定的条件，使其存活而得以延续。菌种保藏机构：中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM)，中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，美国典型菌种保藏中心(ATCC)，世界菌种保藏联合会(WFGC)。,84,传代培养保藏常用的有琼脂斜面、半固体琼脂柱及液体培养等。选择使用适宜的培养基，并在规定的时间内进行移种。传代培养十分繁琐，容易污染，特

27、别是会由于菌株的自发突变而导致菌种衰退，使菌株的形态、生理特性、代谢物的产量等发生变化,85,冷冻保藏使微生物处于冷冻状态，代谢作用停止以达到保藏的目的。微生物细胞对低温敏感，可用速冻、快速升温和添加各种保护剂等手段。液氮保藏或-70低温保藏。用普通冰箱冷冻保存菌种的效果往往远低于低温冰箱，应注意经常检查保藏物的存活情况，随时转种,86,干燥保藏法水分对各种生化反应和一切生命活动至关重要，因此，干燥，尤其是深度干燥是微生物保藏技术中另一项经常采用的手段。沙土管保存和冷冻真空干燥保藏是最常用的二项微生物干燥保藏技术。,87,沙土管保存主要适用于产孢子的微生物，如芽孢杆菌、放线菌等。将菌种接种培养

28、，长出大量的孢子，洗下孢子制备孢子悬液，加入无菌的沙土试管中，减压干燥，抽干水分，最后用石蜡、胶塞等封闭管口，置冰箱保存。此法简便易行，并可以将微生物保藏较长时间，适合一般实验室及以放线菌等为菌种的发酵工厂采用。,88,冷冻真空干燥保藏是将加有保护剂的细胞样品预先冷冻，经真空冰的升华作用除去水分。达到干燥的样品可在真空或惰性气体的密闭环境中置低温保存，从而使微生物处于干燥、缺氧及低温的状态，生命活动处于休眠，可以达到长期保藏的目的。冷冻真空干燥保藏是目前使用最普遍，也是最重要的微生物保藏方法，为大多数专业的菌种保藏机构均采用,89,抑菌剂：能抑制微生物的生长，但不能杀死杀菌剂：能杀死微生物，但不能使其溶解溶菌剂：不但能杀死而且使其溶解灭菌：杀死物体中包括芽孢在内的一切微生物消毒：杀死或灭活物体中病原微生物的措施防腐：防止或抑制微生物生长的一种措施无菌：不含有活的微生物化疗：利用具有选择毒性的物质（化学物质）杀死感染微生物而对宿主无害灭菌技术：防止微生物进入机体或物体的技术,有 关 术 语,90,高 温 灭 菌,