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1、1,资源微生物学Resource Microbiology(第三章),主讲人：周而勋博士、教授、博导（资环学院植物病理学系）电话：38297832(办http:/=850 或,2,第三章 微生物资源的分离和保存,第一节 分离资源微生物的基本原则第二节 各类微生物的分离程序第三节 资源微生物的保存,3,第一节 分离资源微生物的基本原则,一、选择试验样品的原则二、样品采集三、预处理四、培养成分的设计原则五、抑制剂六、关于混合菌,4,一、选择试验样品的原则,1、温度、酸碱度等环境因素（1）温度一些特殊用途的酶，要求能耐高温或低温。现已发现，有的微生物能在80以上生长，最高的可达140。如工业上广泛应
2、用的-淀粉酶，PCR广泛应用的Taq酶，就是从高温菌开发出来的。也有的微生物能在极端低温环境下生长，如寒冷地带或冷冻库中。洗涤剂工业需要的“低温酶”就可从这些微生物中开发。,5,（2）酸碱度如果需要筛选酸性酶、碱性酶，就可分别从酸性或碱性环境分离有关的微生物。总之，在极端环境下（如极端高温、低温、极端酸碱度、高盐、高辐射、低氧）下生存的微生物必然有特殊的代谢类型，也必然产生特殊的产物。这是不可忽视的微生物资源。,6,2、天然基质（1）腐生菌自然界中的大多数微生物靠分解纤维素、木质素、几丁质、角蛋白进行生活，这为我们分离相应酶的产生菌提供了可能性。（2）寄生菌或内生菌有些寄生菌可引起植物病害，但
3、其代谢物有很好的利用价值。如引起水稻恶苗病（徒长病）的真菌可产生赤霉素（商品名“920”），是一种植物生长调节剂，能促进植物生长，已开发利用。,7,赤霉素（“920”）,8,有些内生菌可产生与寄主相同的活性代谢物。如前面谈到，红豆杉（紫杉）的内生真菌安德紫杉菌 Taxomyces andreanae，可产生与从红豆杉（紫杉）提取的相同的抗癌药物紫杉醇。,9,（3）共生菌最常见的共生菌有细菌中的根瘤菌、放线菌中的弗兰克氏菌和真菌中的菌根菌。它们是非常宝贵的微生物肥料资源，有很好的开发潜力。（4）化能自养菌为了利用微生物来回收金属，就要从硫磺矿、硫铁矿等天然环境中采集样品，才能够找到所需的菌种。,
4、10,3、综合因素资源开发的目标常常不是单一因素，而是许多因素的综合。如要开发高温脂肪酶，就要到高温地区的长期炼油或长期贮油的地方取样。又如：要开发高温纤维素酶，就要到堆沤肥的地方取样。总之，根据不同的开发目的，综合考虑各种环境条件，找到符合要求的菌种。,11,二、样品采集,1、土壤采集可采集农田、林地、草地的表层或耕作层(10-40cm)土壤。分离细菌，土样要保持湿润；分离放线菌和真菌，土样可适当风干。2、湖泥、海泥采集采集湖底、海底泥可采用采泥器或重锤式取样器采集。样品装于无菌瓶中，尽可能在短时间内用于试验。,12,3、水样采集根据不同的开发目的，选择不同的水体进行采样。水体包括江、河、湖
5、泊、海洋、污沟以及温泉等。不同的水体含有不同类型的微生物。温泉水中存在的微生物数量少，有必要进行适当的浓缩。方法：用0.5m 滤膜过滤温泉水，滤膜上微生物的浓度大大增加。,13,4、昆虫样品采集在菜园、果园、茶园、林场、草地等场所采集病死的昆虫，最好是长出霉状物的死虫。,14,5、植物样品采集对于根瘤菌，采集根部。对于内生菌，可采集根、茎、叶、花、果实等各部位。对于药用植物（中草药），通常采集药用部分。,大豆根瘤,15,三、预处理,1、富集培养向样品中加入一定数量或浓度的化学物质，如纤维素、角蛋白、几丁质、果胶、维生素、氨基酸、硫磺等，混匀后，适当培养，以增加目的菌的数量。2、高温处理为了分离
6、一些高温菌或芽孢杆菌，对样品进行适当的高温处理，可大大减少其它微生物的数量，而增加目的菌的分离率。,16,四、培养基成分的设计原则,1、开发意图放在分离过程中如果要分离某一特定的目的菌，可使用特定的底物（碳、氮源）和培养条件，以便只分离到目的菌，而其它菌不生长。例如，要开发低温碱性脂肪酶的产生菌，就要满足3个条件：使用脂肪作为唯一碳源，pH调到10以上，在低温下培养。,17,2、大剂量加入同类化合物为了分离产生某类物质的微生物，可在分离培养基中大剂量加入该类物质，有可能使抗这类物质且产生这类物质的菌种生长起来，而不抗这类物的菌种无法生长。例如：酿酒酵母必须对酒精有抗性。所以，在培养基中可加入高
7、浓度的酒精。因为，某种生物活性物质的产生菌，其基因组都是由某种物质的结构基因、调控基因和抗性基因组成的。,18,3、特殊成分除了与开发目的有关的成分外，为了使目的菌生长，有时需在培养基中加入一些特殊成分，如维生素、氨基酸、无机盐等。例如：为了分离硅酸盐细菌，需在培养基中加入长石或硅藻土，而不必加入氮源。4、混合基质如果要分离混合菌，所需的培养基无疑应该使用混合基质。例如：要分离加速垃圾分解的混合菌，就要向培养基中加入纤维素、几丁质等物质。,19,五、抑制剂,1、分离细菌使用放线菌酮和制霉菌素，可抑制真菌的生长，提高细菌的分离率。2、分离放线菌使用重铬酸钾，可抑制细菌和真菌的生长，而几乎不抑制放
8、线菌的生长。3、分离真菌使用青霉素和链霉素，可抑制细菌的生长。,20,六、关于混合菌,分离的本意是得到单一菌种的纯培养。但是在一些情况下，分离资源微生物不一定需要纯培养。例如：分解作物秸杆的菌种就是一类混合菌种。秸杆的主要成分是纤维素、半纤维素、木质素、果胶质等物质，单一的微生物菌种不可能同时具备分解上述各种物质所需要的全部酶。在这种情况下，采用混合菌种的效果就要好得多。,（第三章第一节结束）,21,第二节 各类微生物的分离程序,一、放线菌二、细菌三、真菌,22,一、放线菌,总要求：尽可能让样品中的放线菌都长出来，而其它微生物（细菌、真菌）又尽可能都不长。为了达到这个目的，可从以下几方面来考虑
9、：1、设计多种不同的培养基如：不同营养成分、不同pH值、添加不同抑制剂及其它特殊物质(如维生素、激素)等。2、采用不同的培养条件如不同的培养温度、不同的培养时间等。,23,3、对样品进行预处理目的：减少真菌和细菌的数量，增加放线菌的分离频率。方法：（1）土样自然风干5-30天。（2）风干土样在120干热处理1h。（3）综合处理。如：用0.05%的SDS加1%的腐植酸或6%的酵母膏，40振荡培养20 min。,24,4、放线菌常用培养基高氏1号琼脂培养基：可溶性淀粉 20.0g；K2HPO4 0.5g；MgSO47H2O 0.5g；NaCl 0.5g；FeSO4 10.0mg；琼脂 20.0g；
10、加水至 1000.0ml；pH 7.2。,25,二、细菌,除了第一节叙述的普遍性原则外，分离资源细菌还应注意以下几点：1、培养基成分成分以肉汁（膏）和蛋白胨为主。2、pH值以中性偏碱（）为佳。3、抑制剂可使用50-100g/ml的放线菌酮或制霉菌素抑制放线菌和真菌的生长。,26,4、细菌常用培养基肉汁胨琼脂培养基：牛肉浸膏 3.0g；蛋白胨 5.0g；NaCl 5.0g；琼脂 20.0g；加水至 1000.0ml；。,27,三、真菌,分离一般真菌并不困难。分离资源真菌应注意的问题是：1、以马丁(Martin)和查彼克(Czapek)琼脂为基本培养基。2、pH值以酸性为好一般pH为5.0左右。3
11、、及时纯化单菌落真菌扩展很快，务必及时挑取单菌落纯化，以免菌落间互相污染。,28,4、真菌常用培养基（1）马丁(Martin)琼脂培养基葡萄糖 10.0g；蛋白胨 5.0g；KH2PO4 1.0g；MgSO47H2O 0.5g；琼脂 20.0g；1%孟加拉红 3.0ml；1%链霉素 3.0ml；加水至 1000.0ml；不调pH。,29,（2）查彼克(Czapek)琼脂培养基NaNO3 2.0g；K2HPO4 1.0g；KCl 0.5g；MgSO47H2O 0.5g；FeSO4 0.01g；蔗糖 30.0g；琼脂 20.0g；加水至 1000.0ml；不调pH。（第三章第二节结束）,30,第三
12、节 资源微生物的保存,一、微生物菌种保存的目的二、开发过程中的菌种及保存原则三、资源微生物的长期保存方法,31,一、微生物菌种保存的目的,1、目的在于维持微生物所固有的性状或生产所需要的性能。2、对象具有现实或潜在用途或价值的微生物菌株都应该是保存的对象。3、时间从一开始分离到的菌株，一直到最后开发成功的优良菌株都应该保存。但保持方法有所不同。,32,二、开发过程中的菌种及保存原则,1、待筛菌株的保存（1）何谓待筛菌株？从自然环境或人工环境分离到的、等待筛选的菌株叫待筛菌株。（2）保存方法由于待筛菌株的数量很大，而且很多菌株一般在短期内筛选完毕。所以，待筛菌株的保存一般可采用带螺帽（或橡皮塞）
13、的试管斜面在4下作暂时性保存。,33,2、入选菌株的保存（1）何谓入选菌株？初筛得到的菌株叫初入选菌株；复筛入选的菌株叫入选菌株。（2）保存方法及注意事项获得入选菌株后马上就要进行小试。小试的时间可能较短，也可能较长。所以，菌株要进行妥善保存，以保证菌株在小试期间维持其生产性能。入选菌株一般数量较少，保存方法可多样化。入选菌株一般也可采用试管斜面进行短期或长期保存。但应注意以下几点：,34,尽量减少转代次数对于长期保存的菌种，可采用下述方法：甘油管F1代（-70 超低温）斜面种子管（4）斜面实验菌种管（4或室温）。调换斜面培养基成分在维持生产性能的前提下，调换斜面培养基成分，最好不要长期使用同
14、一种培养基，以免菌种退化。暂时复壮措施有的菌种（尤其是一些细菌）退化较快，可采取以下措施防止退化：将菌株的悬浮液放入消毒过的土壤中，维持50%-70%的湿度，在自然温度下保存一段时间，再从土壤分离生产性能好的单菌落，转移到斜面上保存。,35,三、资源微生物的长期保存方法,1、沙土管保存（1）准备工作：河沙:红土=1:1混合，装于指形管中，灭菌1小时，备用。（2）保存方法：灭菌沙土指形管孢子或孢子悬液放入沙土内常温抽干指形管放进更大的试管，放少量吸湿剂，塞橡皮塞或蜡封室温或4保存。（3）优缺点：制备、保存和使用均方便；适用于产生孢子或芽孢的菌种的保存，一般可保存3年左右。,36,2、甘油保存（1
15、）保存方法：将20%甘油放入指形管中，灭菌将菌体放入甘油内-70保存。（2）优缺点：制备简便；适用于各种菌种（包括不长孢子或芽孢的菌种）的保存，一般可保存3年左右；但需要-70冰箱。,37,3、麦麸保存（1）准备工作：麦麸:水=1:1，拌匀，分装于试管，约2cm高，灭菌，备用。（2）保存方法：在灭菌的麦麸试管中接菌种，培养至菌种产孢为止室温抽干塞橡皮塞或蜡封4或室温保存。（3）优缺点：制备、保存和使用均方便；适用于大多数真菌菌种的保存。,38,4、冻干保存（1）准备工作：100mm8mm的试管或安培管，放入打印好的菌号标签，塞棉花塞，灭菌；装入脱脂牛奶，约高，8磅消毒30分钟2次，备用。（2）保存方法：放入菌悬液冷冻干燥抽真空，火焰封口4或室温保存。（3）优缺点：保存时间可达5年以上，生物活性不易丧失，操作也简单；适用于大多数微生物菌种的保存；但需要昂贵的冷冻干燥设备(真空冷冻干燥机)。,39,40,5、液氮保存（1）保存方法：将10%甘油水溶液注入培养好的菌种斜面，轻刮表面的菌落或菌苔，制成菌悬液吸取0.5ml菌悬液到无菌安培管中，封口将安培管放入液氮冷冻器内，冷却速度为1/分钟使样品冷冻到-35，然后温度可迅速降到-196 并贮存之。（2）优缺点：保存时间长（5年以上），不易失活；但设备要求高。（第三章第三节结束 全章结束）,41,
