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1、,细菌质粒的接合转移 三亲本杂交,微生物遗传学实验,实验原理：1、质粒的转移性,细菌的遗传重组有接合转移、转化和转导三种主要方式。接合转移是指供体和受体细胞间直接接触，质粒DNA从供体向受体转移的过程。质粒可分为可转移质粒和非转移质粒两类，转移质粒带有完整的编码转移酶的 tra 基因,质粒能自主地从一个细胞转移到另一个细胞,甚至还能带动供体细胞的染色体 DNA 向受体细胞转移，这类质粒常被称为自主转移质粒。如大肠杆菌的 F 质粒。有些质粒不含 tra 基因,但含有质粒转移起始位点oriT，虽不能自主转移，但能被其他一些含完整 tra 基因的质粒所诱动,这类质粒又被叫做可诱动质粒。,实验原理：2
2、、本实验所用供体质粒,本实验中要转移的质粒是pHN102，它是在广宿主范围的稳定载体pTR102 中插入生物发光酶基因luxAB 构建而成。pTR102中带有含 par 基因的稳定性片段（stabillty）,它能在较多革兰氏阴性细菌中稳定存在，它含有质粒转移起始位点oriT，不含完整的转移基因 tra，必须在含有 tra 基因的辅助菌株诱动下，pTR102 才能从供体菌向受体菌转移。为有效筛选转移接合子(transconjugant),pHN102 质粒上带有 Tc 抗性和生物 发光酶基因(lux AB）两个 标记。加入lux AB的底物癸醛（Decanal）后，菌体可发出 微弱荧光。,实验
3、原理：3、三亲本杂交,本实验中的辅助菌株是E.coli(pPK2073），pPK2073中带完整的 tra 基因，将已活化的供体菌、协助菌与受体菌混合起来，使菌体细胞紧密接触，供体菌中的质粒（pHN102）可以在协助菌的帮助下通过接合转移方式导入受体菌（费氏中华根瘤菌Sinorhizobium fredii）中。因此该接合转移过程称为三亲本杂交。实验菌株供体菌：E.coli DH5(pTR102-luxAB)(TcR、luxAB)受体菌:Sinorhizobium fredii(Tc S)辅助菌:E.coli MM294(pRK2073)（SpecR）实验产物转移接合子:S.fredii(pT
4、R102-luxAB),(TcR，luxAB),实验准备,菌株活化（教师做）：将受体、供体、辅助菌分别培养到对数期：E.coli(pTR102-luxAB):液体LB+Tc 20g/ml,37OC震荡培养1夜；S.fredii:TY液体,28OC震荡培养2天；E.coli(pPK2073):液体LB+Spe 50g/ml,37OC震荡培养1夜倒平板（学生做）：第1、2组：倒不加Tc的SM（平皿上标记“纯SM”）：融化SM后，每瓶加混合维生素0.2ml（装在1.5ml离心管中，标记“维”)，混匀倒平板，3瓶250ml的培养基共倒3640皿。凝固后，报纸包好，放冰箱冷藏室（4OC）备用。第3、4组
5、：倒TY平板：融化1瓶TY固体,倒平板12-13个,凝固后分发到4个超净台使用。第5、6组：倒SMTc平板（平皿上标记“SMTc”）：融化SM后，每瓶加混合维生素0.2ml和四环素0.5ml（Tc,10mg/ml,装在1.5ml离心管中，标记“Tc”），混匀倒平板，3瓶250ml的培养基共倒3640皿。凝固后，报纸包好，放冰箱冷藏室(4OC)备用。,操作步骤：三菌混合培养（第1天）,(1)吸取供体菌、辅助菌各 0.4ml，吸受体菌0.6ml，都加入同一个1.5ml离心管内（每个同学做1管），8000转/min 离心1分钟。(2)倒上清，向沉淀加 1ml 的 TY液体，用 tip上下抽吸，洗涤菌
6、体，再8000转/min离心1分钟，倒上清，留沉淀。(3)用镊子取灭菌滤纸片贴于已准备好的TY平板上（每个同学1片，3片/平板，平皿背面标记姓名），用200l的 tip 抽吸离心管内沉淀的菌体，打散成浓菌液，将之加到滤纸片中央（切勿倾斜平板，以免菌液流出滤纸片以外）(4)加好菌液后，静置510分钟，待滤纸上的培养基液体被平板吸收后，倒置放培养箱，28OC培养1天。,操作步骤：洗菌涂平板（第2天）,（1）灭菌小PA瓶中加5ml无菌水(1瓶/人),镊子揭下TY平板上的滤纸片，放入瓶中，在震荡混匀器上充分打散菌体。（2）向1.5ml管加0.9ml无菌水,加0.1ml已打散的菌液,混匀。（3）吸已稀释的菌液分别涂布于昨日倒的 SM+Tc 平板和不加 Tc的纯SM上（每个同学各涂1板，200l/板）（4）放28 OC培养6-7天，下周看结果：在暗室内向培养皿中加10L癸醛，35分钟后即可看到转移接合子的luxAB基因发出的微弱荧光 SM+Tc平板的单菌落数 质粒转移频率 纯SM平板的单菌落数,
