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1、第三节 核酸类药物一、核酸类药物概述 核酸类药物可分为两大类，一类为具有天然结构的核酸类物质，缺乏这类物质会使机体代谢失调，发生病态，提供这类物质，有助于改善机体的物质代谢和能量平衡。第二类为天然结构碱基、核苷、核苷酸结构类似物或聚合物，这一类核酸类药物是当今人类治疗病毒、肿瘤、艾滋病等的重要手段，也是产生干扰素、免疫抑制的临床药物，已经在临床上应用的抗病毒核苷酸类药物有以下一些品种：,随着分子生物学和遗传工程的发展，基因治疗应运而生，得到广泛的肯定。其中包括反义核酸技术，简称反义技术。利用这一技术研制的药物称为反义药物，根据核酸杂交原理，反义药物能与特定基因杂交，在基因水平干扰致病蛋白的产生
2、过程，及干扰遗传信息从核酸向蛋白质的传递。反义核酸作为药物与常规药物相比有两个显著特点：有关疾病的靶基因mRNA序列是已知的，因此，设计合理特异性的反义核酸比较容易；反义寡核苷酸与靶基因能通过碱基配对原理发生特异和有效的结合从而调节基因的表达。,它的缺点是天然的寡核苷酸难以进入细胞内、而一旦进入又易被胞内核酸酶水解，很难直接用于治疗。核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因（DNA或RNA）直接导入动物细胞内，并通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白质，诱导宿主产生对该抗原蛋白质的免疫应答以达到防病治病的目的。核酸疫苗又称基因疫苗或基因免疫。DNA疫苗为目前尚无满意疗法的某些疾病（如慢性病毒性肝炎、
3、疟疾、艾滋病）提供一种新的治疗途径。,二、核酸类物质的分离提取及其发酵生产（一）RNA与DNA的提取与制备 1、RNA的提取与制备（l）工业用RNA的提取 RNA及其工业来源 从微生物中提取RNA是工业上最实际和有效的方法。一些最常见的菌体含有丰富的核酸资源，如酵母、白地霉、多种抗菌素的菌丝体。通常在细菌中RNA占525，在酵母中占2.715，在霉菌中占0.7%28。,在菌体内RNA含量的变化受培养基组成影响，其中关键是铵离子浓度和磷酸盐浓度。培养酵母菌体收率高，易于提取RNA。很显然在许多酵母中，早期细胞中的RNA含量高，其确切数值取决于碳、氮比例和培养基组成等。高RNA含量酵母菌株的筛选
4、可以从自然界筛选到RNA含量高的酵母菌株，也可用诱变育种的方法提高酵母菌的RNA含量。工业废水培养高含量RNA酵母 RNA的提取的方法：,稀碱法：是用氢氧化钠溶液（1%），使细胞壁变性，使核酸从细胞内释放出来。需用酸中和pH7。然后除去菌体，将pH调至RNA的等电点（pH2.5），使RNA沉淀出来。此法的缺点是制得的RNA Mr较低,(磷酸单脂酶、磷酸二脂酶降解RNA，90 保持34h破坏酶)。浓盐法：是用高浓度盐溶液（6%8%）处理，同时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。要避免分子降解，可采用苯酚法制备RNA。用苯酚处理生物材料，使蛋白质变性，然后离心，上层水溶液内含有全部
5、RNA，可用乙醇沉淀出来。,脱氧核糖核蛋白溶于浓盐溶液1mol/L,不溶于0.14mol/L,而核糖核蛋白溶于0.14mol/L盐溶液。RNA的提取实例：啤酒酵母是提取RNA的很好的资源。取100g压榨啤酒酵母（含水份70%），加入230ml含NaOH 3g的水，20以下缓慢搅拌30分钟。用6molL HCl调至pH7，搅拌15分钟，离心得清液255m1。冷至10以下，6molL HCl调pH2.5，置冷过夜，离心得RNA l.8g（纯度80）。,2、DNA的提取与制备（1）工业用DNA的提取 取新鲜冷冻鱼精20kg，用绞肉机粉碎2次成浆状，加入等体积水，搅拌均匀，倾入反应锅内，缓慢搅拌，升温
6、至100，保温15分钟，迅速冷却至2025，离心除去鱼精蛋白等沉淀物，获得35L含热变性DNA的溶液，经精确测定DNA含量后直接可用于酶法降解生产脱氧核苷酸。如要制成固体状DNA，在热变性DNA溶液中逐渐加入等体积95乙醇，离心可获得纤维状DNA，沉淀用乙醇、丙酮洗涤，减压低温干燥得DNA粗品，产品含热变性DNA 5060。,2、具有生物活性DNA的制备 动物内脏（肝、脾、胸腺）加4倍重量生理盐水经组织捣碎机捣碎1分钟，匀浆于2500rpm离心30分钟。将沉淀悬浮于20倍重量的冷生理盐水中，加入2倍量5的（用45%乙醇作溶剂）十二烷基磺酸钠，并搅拌23小时，在02500rpm离心，在上层液中加
7、入等体积的冷95乙醇，离心即可得到纤维状DNA，再用冷乙醇和丙酮洗涤，减压低温干燥得粗品DNA。粗品DNA溶于适量蒸馏水，加入5十二烷基磺酸钠达110体积，搅拌1小时，经5000rpm离心1小时，清液中加入NaCl达1molL，再缓慢加入冷95%乙醇，DNA析出，经乙醇、丙酮洗涤，真空干燥得具有生物活性的DNA。,（二）用酶解法、发酵法和半合成法制备核苷酸 1、酶解法及碱水解法制备核苷酸（1）酶解法制备脱氧核苷酸 桔青霉产生5-磷酸二脂酶 红酵母产生3-磷酸二脂酶,（2）酶解法制备戊糖核苷酸 我国从60年代开始使用核酸酶P1降解核糖核酸生产单核苷酸，日本年产呈味核苷酸（肌苷酸和鸟苷酸）3000
8、吨，其中60%是使用酶解法生产的。酶解法生产5单核苷酸工艺流程,（3）双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸（IG）呈味核苷酸的主要品种是肌苷酸钠和鸟苷酸钠，商品名简称为（IG），用核酸酶Pl降解RNA可获得GMP和AMP，其中AMP经脱氨生成IMP。双酶法生产（I十G）工艺。,（4）菌体自溶法生产核苷酸磷酸二酯酶在合适的条件下降解细胞内的RNA可产生5-核苷酸。在国内用谷氨酸产生菌体自溶法生产5-核苷酸。（1）菌体自溶法生产核苷酸工艺流程：,（5）碱水解法生产2，3-混合核苷酸 RNA结构中的磷酸二酯键对于碱性条件不稳定，很容易生成2，3-环状磷酸酯，此环状磷酸酯对碱更不稳定，很易加水分解生成2，3-混合
9、核苷酸。从RNA水解成2，3-核苷酸的降解率达95以上，将2，3-混合核苷酸制成每片含50100mg的片剂。经临床使用，对非特异性血小板减少症、对白血球减少症、癌肿的化疗和放疗后的升白血球均有较好疗效。,2、发酵法生产核苷酸（1）发酵法生产肌苷酸（IMP）（2）发酵生产黄苷酸（XMP）及酶法转化成鸟苷酸,3、半合成法制备核苷酸 由于发酵法生产核苷的产率很高，核苷悬浮于磷酸三甲酯或磷酸三乙酯中，在冷却条件下加入氯化氧磷，进行磷酸化，从核苷生成5-核苷酸收率可达90%。例一：肌苷2mmolL悬浮于5ml磷酸三乙酯中，温度控制0，添加氯化氧磷6mmolL，水2mmolL，反应2h，5-IMP摩尔产率
10、达91。例二：鸟苷2mmolL悬浮于5ml磷酸三甲酯中，温度控制0，添加氯化氧磷6mmolL，水2mmo/L，反应6h，5-GMP摩尔产率达90%。,（三）核苷的制备本节叙述核苷的化学法和发酵法生产。1、RNA化学水解法制备核苷（1）核苷生产工艺流程RNA经甲酰胺化学水解制备核苷,2、发酵法生产核苷 发酵法生产核苷是近代发酵工程领域中的杰出成果，产率高，周期短，控制容易，产量大。用发酵法生产各种核苷的菌株有着许多共同特点：它们都使用磷酸单酯酶活力很强的枯草芽孢杆菌或短小芽孢杆菌为诱变出发菌株；它们都是通过使用物理或化学诱变方法选育出在遗传性状上具有特定标记的诱变菌；它们在发酵培养时必须提供限量
11、的生长因素，并且好氧，在某一特定的范围内累积大量核苷。,（1）发酵法生产肌苷(枯草杆菌)（2）发酵法生产鸟苷和黄苷(肌苷产生菌)（3）发酵法生产腺苷(产氨短杆菌)三、重要核酸类药物的制备,一、叠氮胸苷（Azidothymidine，AZT）（一）结构与性质 AZT是1987美国FDA批准的治疗艾滋病的新药。AZT的药理作用是人体内经磷酸化后生成了3-叠氮-2-脱氧胸腺嘧啶核苷酸，后者取代了正常的胸腺嘧啶核苷酸参与病毒DNA的合成，含有AZT成份的DNA不能继续复制，从而达到阻止病毒增殖的目的。（二）生产工艺 此合成路线的起始原料是胸苷。,（二）阿糖腺苷Adenine arabinoside1、
12、结构与性质 阿糖腺苷的化学名称为9-D-阿拉伯呋喃糖腺嘌呤，或称腺嘌呤阿拉伯糖苷。早在1960年就在实验室合成了阿糖腺苷，1969年美国用Streptomyces antibioticus NRRL3238菌株，1972年日本用Streptomyces hebacecus 4334菌株发酵法分别制备了阿糖腺苷。1979年用 从EColi中分离得到的尿嘧啶磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶，以固相酶的方法将阿糖脲苷转化为阿糖腺苷。,2、生产工艺（1）酶-化学合成法 最新的阿糖腺苷的合成法是酶-化学合成法：用尿苷为原料生成氧桥化合物，水解成阿糖尿苷，经酶法转化成阿糖腺苷。经选育的优秀菌株是产气肠杆菌，能产
13、生尿苷磷酸化酶（Upase）和嘌呤核苷磷酸化酶（Pynpase），从阿糖尿苷和腺嘌呤能高效地合成阿糖腺苷，菌体也可制成固定化细胞进行连续生产。,（2）以5-AMP为原料的化学合成3、作用与用途 阿糖腺苷是近年来引人注目的广谱DNA病毒抑制剂，对单纯疱疹、型，带状疱疹，巨细，牛痘等DNA病毒，在体内外都有明显抑制作用。而且阿糖腺三磷对于病毒DNA聚合酶的亲和性比宿主细胞的同一个酶的亲和性高。因此这个药物对于抑制病毒具有较高选择性。,（三）三氮唑核苷1、结构与性质 三氮唑核苷商品名病毒唑，对DNA病毒，RNA病毒都有广泛作用。这个化合物在体内被磷酸化成三氮唑核苷酸，抑制病毒DNA合成。,2 生产工
14、艺 酶合成法 使用产气肠杆菌，以（尿苷）肌苷和TCA（三叠氮羧基酰胺）为底物可以用酶法简易地合成三氮唑核苷,采用前段与后段由两个不同的酶催化，即前段使用嘧啶核苷磷酸化酶，后段使用嘌呤核苷磷酸化酶。四、阿糖胞苷（一）结构与性质 阿糖胞苷又称胞嘧啶阿拉伯糖苷，糖的组成部分是阿拉伯糖。阿糖胞苷进入体内转变为阿糖胞苷酸，抑制DNA聚合酶，抑制DNA的合成，干扰DNA病毒繁殖和肿瘤细胞增殖。,（二）生产工艺 1以5CMP为原料的合成法（1）工艺路线：,2、以葡萄糖酸钙为原料的合成路线,（五）聚肌胞苷酸（聚肌胞）1、结构与性质 1967年美国人Field发现聚肌胞是干扰素诱导物，而且具有广谱抗病毒作用。本
15、品是人工合成的干扰素诱导剂，系由多聚肌苷酸和多聚胞苷酸组成的双股多聚核苷酸。本品可溶于0.85氯化钠溶液。2、生产工艺聚肌胞生产工艺如下：1）底物5-核苷二磷酸吡啶盐的制备2）固定化多核苷酸磷酸化酶,（3）固定化多核苷酸磷酸化酶，将分离纯化的酶液滴加入冰浴中的载体，得到共价结合的固定化多核苷酸磷酸化酶。3、Poly I：C制备（1）底物预处理：CDP吡啶盐转成锂盐，IDP吡啶盐转成钠盐。（2）酶促反应：（每毫升反应液含molL数）IDP或CDP 15；Tris 150；MgC126；,EDTA 1；聚合酶5单位，pH9.0，37，34小时。用盐酸调pH1.52.0，使PolyI（或Poly C
16、）沉淀，立即离心。此后在磷酸液冲液中溶解，等摩尔Poly I与Poly C混合，生成产品。（三）作用与用途 本品具有抗病毒，抗肿瘤，增强淋巴细胞免疫功能和抑制核酸代谢等作用。本品注入人体诱导产生干扰素。,六、胞二磷胆碱（CDP-胆碱）（一）结构与性质 胞二磷胆碱其化学名称为胞嘧啶核苷-5-二磷酸胆碱钠盐本品为白色无定形粉末，易吸湿，易溶于水，几不溶于乙醇、氯仿、丙酮等多数有机溶剂。,（二）生产工艺1、酶合成法 胞二磷胆碱由微生物菌体所提供的酶系催化胞苷酸和磷酸胆碱而合成，国内使用啤酒生产中废弃的酵母，反应体系为：磷酸二氢钾氢氧化钠缓冲液（pH8.0）200molml，CMP 20molml，磷
17、酰胆碱 30molml，葡萄糖 1000molml，MgSO4.7H2O 20molml，酵母泥 550mgm1。上述反应体系于28保温20小时，胞二磷胆碱对胞苷酸的收率为80。,2粘性红酵母发酵法 国外发现一株粘性红酵母可高产胞二磷胆碱。菌体培养基（gL）：葡萄糖50；多胨5；酵母膏2；KH2PO4 2；（NH4）2HPO4 2；MgSO4.7H2O 1；pH6.0，经28，22h培养，收集菌体，菌体经0.2molL磷酸缓冲液pH7.0洗涤，备用。产生胞二磷胆碱的反应体系（gL）：葡萄糖140；MgSO4.7H2O 6；5CMPNa2 20；磷酸胆碱20；析干菌体50；反应体系中保持磷酸缓冲缓pH7.0、0.2molL，30，28小时产胞二磷胆碱9.8gL，对5-CMP收率92.5。,提取工艺：反应液离心除去菌体，用0.5molL KOH调pH8.5，上dowex 12（酸型）树脂，水洗后用甲酸梯度洗脱，在0.04molL甲酸洗脱液中收集产品，含胞二磷胆碱溶液上活性炭柱，丙酮-氨水溶液洗脱，减压浓缩，乙醇中结晶。（三）作用与用途 胞二磷胆碱是卵磷脂生物合成的前体。当脑功能下降时，脑组织内卵磷脂含量显著减少。本品能促进卵磷脂生物合成，从而改善脑循环和脑代谢，大大提高患者的意识水平。临床用于减轻严重脑外伤和脑手术伴随的意识障碍，治疗帕金森氏症，抑郁症等精神疾患。,
