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1、昆虫线粒体基因组研究方法,一.昆虫线粒体基因组的研究意义,（一）适合做进化生物学研究。被广泛用于研究基因组结构和功能、群体遗传结构，谱系地理学和各种分类学水平上的系统发育关系研究。（二）功能基因的研究,二.研究方法,（一）获取待研究昆虫的线粒体基因组（二）对线粒体基因组结构进行分析（三）与其他昆虫线粒体基因组进行比对（四）进行系统发育分析,具体步骤,1.采集标本并冷冻2.提取DNA3.扩增线粒体基因组上的经典片段4.设计引物，扩增其他片段5.将所有片段拼接成完整的线粒体组（环形）6.校对数据，利用软件、比对等方法，标出tRNA、16S、12S及13个蛋白质基因的位置，上传线粒体基因组数据至Ge
2、nbank。7.对tRNA进行结构预测8.对12S及16S进行结构预测9.对该昆虫线粒体基因组上特殊位置进行讨论10.系统发育分析,1.采集标本及冷冻,利用高压汞灯及黑光灯诱集，然后将标本低温冷冻致死，取一侧后足泡入无水乙醇，置于-20度冰箱保存，供提取DNA。标本展翅并保存，以待进一步形态鉴定。,2.DNA提取,总DNA提取试剂盒为德国默克公司QIAGEN DNeasy Tissue kit。PCR试剂使用TIANGEN天根生化科技有限公司生产的PCR MasterMix。将浸泡于无水乙醇中的足取出，晾干，分成2-3段，放在1.5ul的离心管中。按照QIAGEN DNeasy Tissue
3、kit使用手册的说明进行总DNA提取。抽提的DNA溶于200-300ul的AE缓冲液，并置于在-20冰箱保存备用。,3.PCR扩增和测序,先扩增线粒体基因组上的经典片段，如CO、CO、CO、Cob等。例：扩增COI基因片段扩增引物为通用引物LCOI490（5-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3）和HCO2198（5-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3）（Folmer et al,1994）。反应体系为25l，其中上下游引物各0.5l，PCR MasterMix 12.5l，DNA模板3l，ddH2O 8.5l。扩增反应条件：预变性94 2分钟，变性94
4、 1分钟，退火50 1分钟，延伸72 1分钟,进行35个循环。取3l PCR扩增产物使用1%的琼脂糖胶电泳检验。PCR产物测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。,4.设计引物，扩增其他片段,利用软件Primer5.0 设计引物，扩增其他片段。最难扩增的片段是控制区（A+T-rich）。因为引物很难设计，所以需要花费一些时间及精力。,5.将所有片段拼接成完整的线粒体组（环形）,利用软件DNAstar对扩增好的各个片段进行拼接。用Bioedit软件查看测序原始峰图，校对各个碱基。将校对好的数据上传至Genbank。获取Genbank的accessionnumber。,6.寻找tRNA及预测tRNA结构,用tRNAscan-SE Search Server 在线软件，寻找tRNA，一次可找出17-19个。其余与其他昆虫线粒体进行比对找出。用DNAsis预测tRNA结构，对于较为特殊的tRNASer(AGN)，需手工画出。,7.预测12S及16S结构,用软件XRNA进行预测。预测不到的，用手工画出。,8.对特殊结构进行分析讨论,例：控制区的结构分析在线软件 Mfold Web Server(Zuker,2003;http:/mfold.rna.albany.edu/?q=mfold),9.系统发育分析,用软件MEGA5.0，RAxML,Paup4.0,mrbayes等软件进行分析,
