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1、赵述淼 博士华中农业大学生命科学技术学院农业微生物学国家重点实验室,水产微生态制剂的生产及应用,目 录,一、养殖水体污染二、水产微生物制剂,一、养殖水体污染,1、养殖水体污染的来源,养殖生态环境的外来污染 养殖生态环境的养殖自身污染:多余的饵料：在高密度、集约化养殖过程中，由于养殖密度大，过多的未被养殖动物利用的饵料在养殖池塘生态环境中大量的积累以后，就成为养殖池塘生态环境中最为严重的污染物之一。动物的大量排泄物；生物死亡的有机残体.,2、集约化水产养殖的自身污染,自然界良好生态平衡的水体具有自净能力。集约化水产养殖饲料残渣、动物排泄物、动物残体等有机物。2.1 投喂饲料带来的污染：大量饲料未
2、被水产动物转化利用，一部分残存饲料和排泄物转化为浮游微藻类、浮游动物、原生动物和细菌等生物体；另一部分以溶解和固态物质存留在养殖水体和底质中，造成水体富营养化。,2.2 其他投入品的污染：治疗剂、消毒剂、水质改良剂（化学类）和底质改良剂等污染。一方面，消毒杀菌药物改善了养殖生态环境的作用，但也破坏类养殖动物、微生物与环境三者构成的平衡。,3、养殖水体的自身平衡,以对虾为例，养殖前期水体的生态平衡：幼虾除了摄食饲料外，还有菌团、浮游微藻、浮游动物，养殖过程产生的代谢产物包括虾的排泄物、残存饲料和浮游微藻的尸体，经过微生物的降解、转化成为无机元素，促进浮游微藻的繁殖生长，进而促进浮游动物的繁殖，同
3、时微生物在降解有机物过程中得以繁殖形成“菌团”。因此，浮游微藻、浮游动物和细菌菌团构成了对虾食物的来源一部分，养殖系统处于良性循环阶段，自身污染轻。,养殖前期，投喂饲料少，浮游动物、藻类数量也少，所产生的代谢产物不多，生物的总耗氧量低。这段时期内，养虾池溶氧比较充足，有机质经好氧微生物分解产生二氧化碳、水及硝酸盐和硫酸盐、磷酸盐等无机盐类，为浮游单细胞藻类进行光合作用提供营养，而浮游单细胞藻类的光合作用有为对虾的呼吸和有机质的氧化分解提供氧气。整个生态环境处于相对稳定的良性循环状态。,养殖前期虾池水体微生态的良性循环,4、对虾养殖中、后期微生态的演变,投喂饲料增加，代谢产物增多，有机耗氧量越来
4、越大。在养殖水体的表层，浮游微藻的光合作用比较旺盛，可以使水体中有足够的溶解氧，供给好氧性微生物的活动，促使微生态的良性循环。而在养殖水体的下层和底层，浮游微藻的光合作用微弱，水体中溶解氧含量低，很快就被代谢产物的氧化分解所消耗，好氧微生物的活动受到抑制，使得厌氧性或兼性厌氧微生物大幅度生长成为优势菌群。厌氧消化降解有机物产生大量的氨、有机酸、胺类、硫化氢、甲烷等养殖动物有毒的产物，引起虾等中毒、致病。,养殖中、后期下层和底层水体微生态的不良循环,5、养殖水体的污染元素,1、高浓度的有机污染物被微生物将含氮有机物进行氨化、硝化作用而产生对养殖动物有害的氨态氮、亚硝态氮等有害物质，并且水产养殖动
5、物一般是排氨类生物，这样增加水体中氨态氮的含量。过高的氨态氮、亚硝酸盐对养殖动物具有很强的毒性；氨氮的耗氧特性会使水体的溶解氧降低，从而导致鱼类死亡和水体黑臭。,2、含氮有机物分解的同时，蛋白质中的含硫氨基酸也被分解产生H2S；3、COD和磷,微生物净化剂就是要加强微生物的分解作用，减少富营养物质在水中的累积。,6、微生物方法污水处理及养殖水体净化,水产养殖动物的疾病与水域生态环境关系非常密切，如不改善水质，水产动物的健康就得不到保证，水域生态环境就会破坏，病害会越来越多。因此，水产养殖环境的净化已成为水产健康可持续发展的关键。,微生态制剂是在微生态学理论指导下，从自然界或动物分离、鉴定或通过
6、生物工程技术人工组建的有益微生物，经培养、发酵、干燥、加工等特殊工艺制成的含有活菌或者包含细菌菌体及其代谢产物并作用于环境或动物的生物制剂或活菌制剂。,二、水产微生态制剂,2008年中华人民共和国允许使用的安全微生物,资料来源：农业部公告1126号（2008）,水产微生态制剂种类,光合细菌芽孢杆菌乳酸菌类硝化与反硝化细菌酵母菌蛭弧菌,光合细菌（photosymthetic bacteria,简称PSB）是一大类能进行光合作用的原核生物的总称，分为产氧光合细菌和不产氧光合细菌两大类。产氧光合细菌主要是蓝细菌，或称之为蓝藻和原绿藻，在分类上属于藻类。这里所说的光合细菌之能在厌氧光照条件下进行不产氧
7、的光合作用的原核生物。分为4个科：红螺菌科、着色菌科、绿菌科和绿曲菌科。主要特征：A 含有光合色素菌绿素；B 在厌氧、光照条件下进行光合生长，且不产氧。,1、光合细菌,光合细菌的类群,红螺菌科（即原名紫色非硫细菌）荚膜红假单胞菌(R.capsulata)。沼泽红假单胞菌(R.palustris)深红螺菌(Rsp.rubrum)：菌体呈螺旋状，运动较快。胶质红假单胞(R.capsulata)现名Rhodobacter capsulata绿色硫细菌（Green sulfur bacteria,即绿硫菌科）紫色硫细菌（Purple sulfur bacteria）,光合细菌除了可在厌氧和光照条件下进
8、行不放氧的光合作用外，绝大部分还具有固氮作用，能直接利用水环境中的溶氧合成有机物，并在厌氧的环境中以硝酸盐或亚硝酸盐作为主要的代谢上的氧化剂，因此可以直接消耗水中的硝酸盐和亚硝酸盐。光合细菌还可迅速利用低分子有机物，其中的一些种还具有反硝化活性和积磷的特性，有较好的脱氮和除磷效果。常用于废水处理的是红螺菌科的一些种，因其细胞结构及独特的物质、能量代谢使之能在有机废水处理中显示出其他菌种无法比拟的优越性。,光合细菌PSB在水产中的应用,净化水质：由于光合细菌的上述代谢特性，光合细菌以小分子有机物、二氧化碳等作碳源，氨、铵盐、硝酸盐或亚硝酸盐作氮源，使得光合细菌可以在水质净化中发挥重要作用，有效地
9、除去水体中H2S，降低水体中氮及COD，以光合细菌作为水质净化剂对于改善养殖水体的水质有明显的效果。,提高养殖池塘的能量转化效率：以投饵为重要增产技术的精养池塘，随着时间的延长，常因有机质投入过多，超过了池塘生态系统的消耗与转化能力，造成循环不畅，池内有机质的大量沉淀，产生严重的能量陷阱效应，致使池塘的能量转化效率偏低。由于PSB挥发其处理低分子有机物、转化H2S等有害物质的作用，促使池塘内N、P陷入能量陷阱的效应降低，加之这种转化在黑暗、弱光和厌氧条件下进行，从而起到增氧和降低H2S的效能，因而提高了单产和池塘的能力转换效率。,光合细菌在水产养殖中的其他功效,作为饵料添加剂：PSB 富含蛋白
10、质,还含有各种B族维生素、矿物元素及其他未知的生理活性物质等，因此可为水体中的浮游动物和水产养殖动物提供丰富的饵料。光合细菌菌体蛋白质含量高，并含有大量促进鱼虾生长的活性因子，如生物素、维生素、-类胡萝卜素等，可明显促进养殖生物的生长发育，缩短养殖周期。,增强水产养殖动物的抗病性：在同一生态位中微生物通过营养竞争、空间竞争或分泌抗生素、细菌素等毒素抑制其他微生物的生长。光合细菌是水体中的快速繁殖使得其成优势菌，可以抑制病原微生物的生长，防止鱼虾病害的发生。作为免疫增强剂：如荚膜红假单胞菌细胞壁中含有的多糖类物质是非特异性免疫增强剂，使鱼类的免疫球蛋白提高10倍以上。此外，类胡萝卜素对提高免疫力
11、效果明显。,光合细菌制剂的剂型,市场上见到的光合细菌剂型大致有液体制剂、浓缩液、固体制剂、冻干粉等。相对而言，液体制剂较容易大量培养和批量生产，且培养物的活性较强，光合细菌的代谢物含量丰富。应用效果也较好，目前在各剂型中是使用量最大的一种。,光合细菌的各种生产方式,光合细菌培养必需条件,光能异养型微生物光照适宜的温度培养基 碳源、氮源、无机盐、生长因子,光合细菌存在的问题与任务,曾经兴起的光合细菌的热潮，遇到诸多的问题，甚至在水产养殖业的应用几乎停顿。产品质量低劣，标识量极高，实际仅活菌数仅一亿，养殖效果差。未来重点：如何筛选活性强、适应面广，容易培养的菌株。,2、有机矿化菌（芽孢杆菌类）,枯
12、草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），使用最广泛的微生态制剂。特点：它们能分泌多种胞外酶，把大分子有机物质如淀粉、脂肪、蛋白质、核酸、磷脂等分解成小分子有机物，再进一步矿化生成硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐等无机盐类。,芽孢杆菌菌落与菌体形态,芽孢杆菌在水产养殖中的应用,第一，有些芽胞杆菌属在鱼虾肠道内、体表上繁殖，形成优势菌群，促进该部位有益细菌生长繁殖，竞争性抑制肠道、体表致病菌繁殖，提高鱼虾免疫力，有效预防疾病。第二，芽胞杆菌在繁殖过程中大量产生蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶，能迅速降解鱼虾残留饵料和排泄物中蛋白质、淀粉、脂肪等有
13、机物，在池内其他微生物的共同作用下，大部分进一步降解为二氧化碳和水，降低养殖水体富营养化和减少底泥生成。,1）芽孢杆菌对氮、磷沉积的影响：减少底质环境中氮、磷的沉积。因为，水产养殖往往需要培养优良的浮游单细胞藻类，营造合适的水色。在生产上施肥增加水体的营养盐含量，以培养单细胞藻类。但是，施肥带进的营养盐物质在池底沉积被固定。芽孢杆菌具降解有机物和解氮磷功能，不仅源源不断给单细胞藻类提供营养盐，而且可以避免池底沉积物的富营养化，维持生态平衡。,2）由于芽孢杆菌降解、转化有机物速度快，可以有效改善改善池底缺氧状态，减少硫化物的累积。3）芽孢杆菌消化酶活性高，具有降解残存饲料、排泄物和生物残体等有机
14、物，矿化营养物质供浮游单细胞藻类生长繁殖。保证了有机物氧化氨化硝化反硝化的正常循环，降低氨氮、亚硝酸盐等有害物质。,缺点,芽孢杆菌生长速度快，能迅速降解养殖池中鱼虾排泄物、残饵、尸体等的有机物。但是，部分芽孢杆菌具有硝酸盐还原能力，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。因此，在水质急剧恶化的养殖水体中使用芽抱杆菌制剂，起初氨氮水平快速降低，亚硝酸随之也降低，但随后水体中亚硝酸盐含量出现反弹。因此，水体中亚硝酸盐含量的反弹，是芽孢杆菌制剂的主要缺点。耗氧微生物！,剂型：粉剂或片剂。培养方式：固体或液体发酵。菌数：几亿到一万亿不等。市面上产品：10200亿/g,益生菌产品关键控制点：1、优良菌种2、发酵水平,
15、芽孢杆菌的发酵生产,初始含水量对芽孢产量的影响,初始pH对芽孢产量的影响,发酵温度对芽孢产量的影响,固体培养基与发酵条件研究,培养中的芽孢及温度变化曲线,培养48 h菌体显微照片,高密度固体发酵工艺,3、硝化与反硝化细菌,反硝化细菌是指能利用硝酸盐、亚硝酸盐进行反硝化作用的一类微生物的总称。研究者已经报道反硝化细菌的种类很多,大约有50多个属，130多个种。,（1）反硝化细菌,自然界N循环,反硝化细菌与硝化细菌的作用方式比较,（2）硝化细菌,硝化细菌是一类能降解氨和亚硝酸盐的自养型细菌,包括亚硝化菌属(Nitrosomonas)和硝化杆菌属(Nitrobacter)两个生理亚群，它们归属于一个
16、独立的科硝化杆菌科。硝化杆菌科包括九个属,它们分别是：硝化杆菌属(Nitrobacter)、硝化刺菌属(Nitrospina)、硝化球菌属(Nitrococcus)、硝化螺菌属(Nitrospira)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、亚硝化螺菌属(Nitrosospira)、亚硝化球菌属(Nitrosococcus)、亚硝化叶菌属(Nitrosolobus)、亚硝化弧菌属(Nitrosovibrio)。,硝化细菌的特性,(1)硝化细菌的自养性：硝化细菌是一种专性化能自养菌，能通过硝化作用利用亚硝态氮获得能量，并且以CO2作为唯一的碳源,是典型的化能无机营养菌。(2)生长速度慢：因硝
17、化细菌由自身合成糖类,这一过程需要相当长的时间，平均代时在10h以上。(3)好氧生长，O2 是最终的电子受体。(4)形态多样：同一生理亚群中的种类，尽管生理学上具有共同性，但细胞形态多种多样，如球形、杆状、螺旋形等。(5)革兰氏阴性，无芽孢。,硝化细菌的作用机理,硝化作用指的是硝化细菌在好氧条件下将NH3氧化为NO2-，并进一步氧化为NO3-，从中获得生长所需能源的过程。因此，常讲的硝化作用实际上包括了由亚硝化细菌完成的亚硝化作用和由硝化细菌完成的硝化作用两个阶段。前一阶段NH3 氧化为NO2-，称为亚硝化作用或氨氧化作用，由亚硝化细菌完成；后一阶段是NO2-氧化为NO3-的过程，称为硝化作用
18、，由硝化细菌完成。,硝化细菌的分离培养,硝化细菌生长速度较为缓慢,平均世代一般在以上20h以上。要求首先分离筛选出高效硝化细菌,并采用有效的方法进行富集培养。来源：湖底表层淤泥。,4、乳酸菌类,主要成分为乳酸菌。常用菌种包括：嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、粪链球菌、保加利亚乳杆菌等。剂型：水剂、粉剂或冻干粉。,微生物特点：能产生乳酸、抗菌肽等物质抑制病原微生物的生长，消除水体异味，改善水色。内服可以改善水产动物肠道微生态，预防疾病。液体制剂产品活菌数每毫升0.1到5亿，保质期6个月。,乳酸菌群光合菌群酵母菌群 VA菌根菌放线菌群80多种微生物日本琉球大学技术,EM原露背景知识,?,产品执行标准：嗜酸乳杆菌1106 个/mL,所谓EM菌剂就是乳酸菌液体培养物！,5、酵 母,主要成分：啤酒酵母，粘红酵母在水产养殖中不用于调节水质，仅作饲料添加使用。啤酒酵母一般用于幼苗开口饵料及轮虫培养等。红酵母富含蛋白质、虾青素等，可以促进动物生长和改善动物体色。,安琪产品系列,水产专用饲料酵母、海洋1号红酵母、水产专用酵母细胞壁,6、蛭弧菌,主要成分：噬菌蛭弧菌。能吃细菌的细菌，能消灭水体中致病微生物如弧菌、大肠杆菌、沙门氏菌等，是一种新型的微生态制剂。需作为兽药申报。,Thank You!,华中农业大学生命科学技术学院农业微生物学国家重点实验室,
