沈萍微生物学第七章.ppt

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1、,2007 Baidu,第七章 病 毒,非细胞微生物,本节重点,病毒的特征与定义病毒的噬菌斑法测定病毒的模式结构病毒的三种基本对称形式,第一节 概 述一.病毒的发现二.病毒的特点与定义特征：1.超显微，非细胞生物 2.DNA或RNA+蛋白质 3.专性细胞内寄生 4.以核酸复制，核蛋白装配增殖 5.离体条件-大分子存在（保持侵染活力）6.对干扰素敏感,定义：病毒是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的超显微“非细胞生物”，其本质是一种只含DNA或RNA的遗传因子，它们能以感染态和非感染态两种状态存在。在宿主体内具生命特征，在离体条件下以大分子状态存在，保持侵染性周德庆1999年报告了4000余种

2、病毒,真病毒 至少含核酸和蛋白质非细胞生物 类病毒 侵染性RNA 亚病毒 卫星病毒 非侵染性RNA 朊病毒 蛋白质二.病毒的宿主范围 原核生物-噬菌体 真菌-真菌病毒 植物-植物病毒 动物-动物病毒三.病毒的分类 dsDNA，ssDNA，dsRNA，+ssRNA,-ssRNA，逆转录DNA或RNA，裸露的RNA病毒，亚病毒,第二节 病毒学研究的基本方法,一.病毒的分离和纯化1.病毒的分离（1）标本的采集与处理加抗生素除菌离心、过滤破碎细胞 低温保存、运输；（2）标本接种与感染表现接种细菌噬菌斑 噬菌斑的概念接种单层细胞空斑或蚀斑接种植物叶片坏死斑或枯斑,噬菌斑 噬菌体标本经过适当稀释再接种细菌

3、平板，经过一定时间培养，在细菌菌苔上可形成圆形局部透明区域，为噬菌斑。直径1-3mm左右-负菌落噬菌体-原核生物的病毒 1987年电镜观察过2850种噬菌体,其中2700种有尾。包括蝌蚪状（dsDNA）、球状（ssDNA、ssRNA）、丝状（ssDNA）。温和噬菌体烈性噬菌体,空斑和病斑以单层动物细胞受动物病毒侵染产生的透明斑为空斑。肿瘤病毒感染单层动物细胞，产生细胞剧增。称为病斑 枯斑植物病毒接种敏感植物叶片产生的坏死斑为枯斑,2.病毒的纯化（1）按照纯化蛋白质方法-盐析，等电点沉淀有机溶剂沉淀、凝胶层析、离子交换等；（2）根据颗粒的大小，采用超速离心法10,000100,000g的离心场中

4、12小时沉降，,二.病毒的测定1.用电镜直接计数2.病毒的感染性测定效价测定（1）蚀（噬）斑测定（双层平板法）一个病毒（噬菌体）产生一个噬（蚀）斑 底层平板（2%琼脂培养基7-8ml)37 计数双层 上层1%培养基3ml 10余h 噬菌斑平板法 上层平板 宿主菌悬液 0.2ml 混匀 噬菌体试样 0.1ml,（2）终点法半数效应剂量半数致死剂量 LD50半数感染剂量 ID50,三.病毒的鉴定1.根据病毒感染的宿主范围及感染表现的鉴 定2.病毒的理化性质鉴定3.血细胞凝集性质鉴定4.病毒的血清学鉴定5.病毒鉴定的分子生物学方法,第三节 毒粒性质,一.毒粒的形态结构1病毒的大小：用n m 表示，大

5、小差异较大小的病毒，植物的双粒病毒直径18-20nm 口蹄疫病毒21nm 菜豆畸矮病毒9-11nm 大的病毒，痘病毒大小300450nm170260nm最长病毒,柑桔衰退病毒2000nm最细病毒,大肠杆菌f1噬菌体5800nm,2、病毒的形态,3、病毒的基本结构,无囊膜病毒模式结构,有囊膜病毒模式结构,衣壳,衣壳粒,核酸,衣壳,刺突,病毒的基本结构表解,（1）螺旋对称壳体烟草花叶病毒（TMV）病毒表面的衣壳粒有规律地螺旋排列，形成一中空柱，核酸（ssRNA）位于衣壳内侧螺旋状沟内。TMV给烟草带来极大的危害,病毒的结构类型,（）二十面体对称壳体腺病毒腺病毒252个衣壳粒，排成二十面体结构，核酸

6、位于中心多瘤病毒72个衣壳粒；脊髓灰质炎病毒32个衣壳粒。,（3）双对称壳体T4噬菌体 蝌蚪形：头部、颈部、尾部三部分 头部为20面体结构 尾部为螺旋对称结构,病毒的壳体结构类型表解,螺旋对称结构,二十面体对称结构,复合对称结构,无囊膜,杆状：烟草花叶病毒等丝状：大肠杆菌M13噬菌体等,卷曲状：流感病毒等弹状：狂犬病毒等,有囊膜,无囊膜,有囊膜：疱疹病毒,小型：脊髓灰质炎病毒大型：腺病毒,有囊膜：痘病毒（砖块状）,无囊膜：大肠杆菌T偶数噬菌体（蝌蚪状）,病毒结构类型,病毒壳体结构类型图示,二.毒粒的化学组成,1、病毒的核酸：核酸是病毒的遗传物质，一种病毒只含有一种核酸。类型：+ssDNA,-s

7、sDNA,dsDNA,dsRNA-ssRNA,+ssRNA动物病毒-有些是DNA，有些是RNA(ds ss)植物病毒-大部分是RNA(ds ss)噬菌体-大部分是DNA（ds ss）藻类病毒-双链DNA,结构：逆转病毒5-cap,3-polyA,分段基因组，黏性末端，循环排列，末端重复，含量：1%-50%流感V 1%TMV 5%T2噬菌体 50%,2.病毒蛋白质功能1.主要是构成病毒粒子的外壳，保护病毒核酸；2.决定病毒感染的特异性，与宿主特异亲和；3.具有抗原性，能刺激集体产生相应的抗体。,种类：1.结构蛋白：有感染性的病毒所必需-壳体蛋白，包膜蛋白2.非结构蛋白：病毒复制所需的蛋白-毒粒酶

8、一些简单病毒仅由一种或几种蛋白质构成，一些复杂的可多达20余种。,其他成分病毒的脂类：存在于包膜中，来源于宿主细胞，50-60%为磷脂，余 下为胆固醇，构成脂双层结构 病毒的糖类：糖蛋白，粘多糖，糖脂形式与宿主有关,噬菌体种类,T2，T4,T3，T7,M13,X174,6,dsDNA,ssDNA,ssRNA,Ms2,dsRNA,思考题,真病毒与亚病毒，噬菌斑与枯斑，绘制病毒模式结构绘制大肠杆菌T4噬菌体结构病毒区别其他生物的特征,第七章 病 毒（续）,本节重点,病毒的一步生长曲线病毒增殖的五个阶段各类亚病毒的特征,第四节 病毒的复制,一.病毒的复制周期 1.一步生长曲线,吸附期,隐蔽期,潜伏期

9、,裂解量,相对病毒浓度/感染单位,时间,潜伏期：从病毒核酸侵入到开始释放子代病毒粒子的时间。大肠杆菌约25min 隐蔽期：从从病毒核酸侵入到细胞内出现新的感染性病毒的时间。裂解量：每个受染细胞所释放产生的子代病毒数目，几十到上千个。裂解量=平稳期的平均噬菌斑数/潜伏期的平均噬菌斑数,2.病毒的复制周期 吸附 释放 侵入（脱壳）装配 病毒大分子合成,二.感染的过程1.吸附病毒-吸附蛋白寄主-细胞受体不同噬菌体吸附的位点不同，如脂多糖、脂蛋白、磷壁酸、鞭毛等，吸附可以受外界条件的影响，如阳离子、辅助因子、pH、温度等。感染复数（）每一个敏感细胞所能吸附的相应噬菌体的数量称之 一般可达到250-36

10、0，超大可引起自外裂解,2.侵入噬菌体 尾部水解酶水解CW为一孔 注入核酸 留壳于外T4噬菌体从吸附到侵入只需15秒，吸附引起构象变化，将核酸注入宿主细胞内，而蛋白质外壳留在细胞外，如果两种以上侵入，只有一种得以增殖。,1、吸附2、侵入,动物病毒 移位 内吞 融合 脱壳-脱壳酶植物病毒 伤口进入（人为，机械，自然）昆虫口器 嫁接,3.病毒大分子合成 病毒核酸复制 病毒核酸转录 病毒蛋白质翻译T4噬菌体的dsDNA，早期转录-早期蛋白 酶次早期转录-次早期蛋白 酶晚期转录-晚期蛋白（结构蛋白等）,4.成熟装配噬菌体 头 加尾鞘尾丝 V粒子TMV 17衣壳粒 20S 加RNA 螺旋动物病毒 壳体

11、核壳 V粒子 核酸 包膜5.释放 T4-溶菌 M13-通过CW分泌 动物V-芽出 植物V-胞间连丝扩散释放量大肠杆菌T系列15-25min T2为150个，T4为100个,思考题,1、一步生长曲线2、以噬菌体为例，叙述病毒增殖各个阶段的主要过程。,第七章 病 毒（续）,本章重点,缺损病毒与整合感染温和噬菌体各类亚病毒因子的特征,第五节 病毒的非增殖性感染,一.非增殖性感染的类型1.流产感染 2.限制性感染二.缺损病毒1.干扰缺损颗粒 2.卫星病毒 3.条件缺损病毒4.整合的病毒基因组 烈性噬菌体 概念 动物病毒整合感染 逆转录V,（1）.温和噬菌体和溶源菌整合在宿主染色体上的噬菌体DNA 为前

12、噬菌体，或原噬菌体原噬菌体一旦脱离宿主DNA就开始复制，引起宿主裂解（10-5）。自发裂解 诱发裂解,温和噬菌体与溶原性（lysogeny）某些噬菌体侵染细菌后，将自身基因组整合到细菌细胞染色体上，随寄主细胞分裂而同步复制，并不引起细菌裂解释放噬菌体，因而被称作温和噬菌体（temperate phage）。,温和性噬菌体的三种状态：游离态、原噬菌体态、营养期噬菌体,这种噬菌体与细菌共存的特性称为溶原性（lysogeny），被侵染的细胞被称作溶原性细胞或溶原菌（lysogen），整合到细菌细胞染色体上的病毒被称作前病毒或前噬菌体（prophage）。,噬菌体的裂解和溶原途径,诱导,常见的温和性噬

13、菌体 大肠杆菌噬菌体,Mu-1噬菌体 P1、P2噬菌体 其中大肠杆菌噬菌体研究最清楚，E.coli K12（）表示 cos位点-12个碱基对构成的粘性末端,第六节 病毒与宿主的相互作用,一、噬菌体感染对原核细胞的影响1、抑制宿主细胞大分子合成2、宿主限制系统的改变3、噬菌体释放对细胞的影响4、溶源性感染对细胞的影响（1）免疫性-原噬菌体阻遏蛋白作用（2）溶源转变-噬菌体基因的作用,二、病毒感染对真核细胞的影响1、致细胞病变效应2、对宿主大分子合成的影响3、对细胞结构的影响三、机体的病毒感染1、机体病毒感染的类型2、构成机体感染的因素,病毒的群体特征,1包涵体 某些病毒感染宿主细胞后，在宿主细胞

14、中出现的显微镜可见的小体。有的的细胞质（狂犬病毒）有的在细胞核（疱疹病毒）有的在细胞核、细胞质都有（麻疹病毒）,第七节 亚病毒因子,一.卫星病毒包裹在真病毒颗粒内有缺陷的类病毒能编码自身的壳体蛋白 侵染植物病毒（卫星烟草花叶病毒）侵染动物病毒（乙肝病毒）：丁型肝炎病毒二、卫星RNA包在辅助病毒壳体中不具编码壳体蛋白的能力,表7-4 DI颗粒、卫星病毒、卫星RNA、类病毒性质的比较性质 DI颗粒 卫星病毒 卫星RN A 类病毒依赖辅助病毒复制 是 是 是 否特异性外壳壳体化 否 是 否 否辅助病毒 外壳壳体化 是 否 是 否抑制辅助病毒复制 是 是 是-与辅助病毒序列同源性 是 否 否-在体内和

15、体外RNA的稳定性 低 低 高 高,二.朊病毒100200年前 羊瘙痒病 70年代 克-雅氏病 90年代 疯牛病 1.概念：一类能侵染动物神经系统而复制的小分子蛋白质。疯牛病、羊瘙痒病、早老性痴呆的病源。有极强的抗逆性。是正常细胞蛋白的改造物。借食物进入消化道，再经淋巴系统进入大脑,病羊神经组织的海绵状损伤,蛋白质感染因子的增殖方式有两种解释1、重折叠模型（refolding model），认为PrPSc分子起分子伴侣（molecular chaperone）的作用，能与PrPc分子相结合，诱使PrPc转变成PrPSc，从而形成了PrPSc二聚体，2、晶种模型（Seeding model），认

16、为PrPc分子本身有向PrPSc转变的倾向（一种平衡反应），PrPSc能像晶种一样，稳定PrPc的构象，形成淀粉样蛋白沉淀，然后碎裂后又变成新的晶种。,Prion的结构模型，左PrPc，右PrPSc,2.机制 PrPsc+PrPc 2PrPsc,三.类病毒 概念只含环状ssRNA专性细胞寄生的分子病原体目前已发现多种。侵染植物 马铃薯纺锤形块茎病病原体是359个核苷酸的单链环状RNA分子组成，链内有一些互补序列。分子长约4050nm，不能制造衣壳蛋白。,第八节 病毒举例,一、人免疫缺损病毒HIV 1、概述：发现，分布 传染途径 性传播为主 血液制品 母 子2.HIV形态结构 外膜 外壳 核酸,

17、3、HIV基因组特点2条ssRNA5/cap m7G5/GmpNp3/poly(A)两端有LTR基因编码重叠tat,rev基因有内含子 HIV编码蛋白的功能,4、HIV的复制,吸附 侵入 生物合成 组装 裂解释放RNA ssDNA dsDNA 整合宿主染体 原病毒 宿主转录系统 长期潜伏 mRNA HIV蛋白质,5、HIV致病机理、治疗与预防,24周 出现急性感染症状 56周 进入无症状潜伏期再次发作，HIV重新大量复制造成免疫系统损伤 全身性淋巴腺病 艾滋病相关综合症 艾滋病治疗剂 核酸型反转录酶抑制剂 非核酸型反转录酶抑制剂 蛋白酶抑制剂预防疫苗,致病机理,二、SARS冠状病毒,1、病毒基

18、因组正链RNA，2729Kb，5/cap、3/poly(A)、710个基因2、病毒的复制+RNA-RNA+RNA mRNA Pr 病毒3、症状：4、传播：,三、乙型肝炎病毒HBV,1.HBV基因组结构 部分单链区的环状dsDNA分子L链 3.2Kb 负链S链 正链 为负链的5080 非常密集，高度压缩，重复利用全为蛋白编码区,2、编码区及产物 S编码区 乙肝表面抗原蛋白 S gene 主蛋白 原S2 gene 中蛋白 原S1 gene 大蛋白 P编码区 末端蛋白，反转录酶，RNase C区编码病毒核心蛋白 X区反式调控因子,3.HBV的复制感染 在细胞质中脱壳 入核后DNApol修复正链缺失部

19、分 dsDNA 核内扩增 转录 3.5Kb前基因组RNA 反转录 合成负链DNA 降解前基因组RNA 合成正链DNA（不完整）,病毒的进化地位 无论是病毒还是类病毒都不具有独立进行生物合成的能力，它们都是细胞的寄生物，因此在进化上病毒的出现不可能早于细胞。病毒的前身很可能是在宿主染色体外独立进行复制的质粒,生物病毒的好处1、噬菌体可以作为防治某些疾病的特效药，例如 烧伤病人在患处涂抹绿浓杆菌噬菌体稀释液 2、某些病毒可以作为细胞融合的助融剂，例如仙 台病毒 3、在基因工程中，病毒可以作为目的基因的载 体，使之被拼接在目标细胞的染色体上 4、在专一的细菌培养基中添加的病毒可以除杂 5、病毒可以作为精确制导药物的载体 6、病毒可以作为特效杀虫剂,作业：1、解释：毒粒、一步生长曲线、温和噬菌体、烈性噬菌体、类病毒、朊病毒、原噬菌体、噬菌斑2、病毒区别其他生物的特点是什么？3、图示病毒的模式结构，试述病毒壳体结构有哪几种对称形式？4、病毒复制循环分为哪几个阶段？各阶段的主要过程如何？5、P202 思考题 1,