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1、种子扩大培养,种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。,种子扩大培养应根据菌种的生理特性，选择合适的培养条件来获得代谢旺盛、数量足够的种子。培养良好的种子接入发酵罐后，可使发酵生产周期缩短，设备利用率提高。种子液质量的优劣对发酵生产起着关键作用。,优良种子应具备的条件,活力强生理状态稳定菌体数量浓度达到要求无杂菌污染适应性强，能保证稳定生产,种子制备,实验室制备阶段,实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌
2、种室完成，因此将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。,实验室阶段,培养物选择的原则,目的：种子扩增到一定的量和质，根据菌种的特点可分为两类：,对于不产孢子和芽胞的微生物 获得一定数量和质量的菌体,对于产孢子的微生物,获得一定数量和质量的孢子,（一）孢子的制备1，细菌孢子的制备 细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。培养温度一般为37。细菌菌体培养时间一般为12天，产芽孢的细菌培养则需要510天。2，霉菌孢子的制备 霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。培养的温度一般为2528。培养时间一般为414天。3，放线菌孢子的制备 放线菌的孢子培养一般采用琼脂
3、斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。培养温度一般为28。培养时间为514天。,孢子培养基是为了获得孢子，应注意避免孢子发育为菌体，所以通常使用营养限制的固体培养基。,（二）液体种子制备 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌、产卡那霉素的卡那链霉菌可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。其过程如下：试管三角瓶摇床种子罐,生产车间种子的制备,孢子或摇瓶菌丝在实验室中制备好后，即可转移到种子罐中扩大培养。种子罐的作用是使有限的数量的孢子或菌丝生长繁殖成大量的菌丝体
4、。种子罐的培养基因不同菌种而异，但其原则为营养丰富，采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，同时应考虑与发酵培养基成分相靠近。,生产车间阶段,培养物的选择原则：,在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。,种子扩大的级数,指制备种子需逐级扩大培养的次数，需要根据菌种的生长繁殖速率，发酵罐的容积综合确定。一级种子二级发酵：谷氨酸棒杆菌二级种子三级发酵：青霉菌三级种子四级发酵：灰色链霉菌,种子罐级数取决于：（1）菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度；（2）所采用发酵罐的容积。细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。霉菌：生长较慢，如青
5、霉菌，三级发酵 放线菌：生长更慢，采用四级发酵酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子,种子罐的级数越少，越有利于简化工艺和控制，并可减少由于多次移种而带来染菌的机会。也须考虑尽量延长发酵罐生产产物的时间，缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时间，以提高发酵罐的生产率。,接种龄与接种量,接种龄：种子的培养时间。种龄过于年轻：前期生长缓慢，发酵周期延长种龄过于年老：导致生产能力衰退,接种量：移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。接种量的选择：根据菌种的区别各有不同，高可达发酵罐的25%。通常接种量，细菌15%，酵母菌510%，霉菌715%，有时2025%,接种量的大小决定于生产菌种在
6、发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，节约动力消耗，减少染菌机会。但接种量过大或者过小，均会影响发酵。过大会引起溶氧不足，影响产物合成；而且会过多移入代谢废物，也不经济；过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。,双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。倒种：部分种子来源于发酵罐。,种子质量的判定,通常测定的参数包括pH培养基中营养物质的含量菌丝形态、色泽、浓度酶活，溶解氧，尾气等,种子质量标准1，细胞或菌体菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观（色素、颗粒等）单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列方式；霉菌、放线菌：菌丝
7、粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况好。,2，生化指标 种子液的糖、氮、磷的含量和pH变化。3，酶活力 种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定的关联。,影响种子质量的因素,培养基原材料质量 生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。例如在四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量的影响也不同。蛋白胨加工原料不同如鱼胨或骨胨对孢子影响也不同。,培养条件 如温度、PH值、湿度、培养时间和冷藏时间等都影响种子质量。,种子质量的控制,菌种的稳定性检查与复壮无杂菌检查,青霉素生产的种子制备,
8、制备过程,安培管,斜面孢子,大米孢子,一级种子,二级种子,发酵,斜面孢子,培养基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等,培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细,培养条件：25、7天，湿度50%左右,大米孢子,培养基：大米及氮源（玉米浆）,培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高，比表面积大，利于氧的传质，营养适当有利于孢子的生长。,培养条件：25、7天，控制湿度,大米孢子的要求：1粒米含1.4*106个孢子,一级种子,培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆,目的：长菌体,培养条件：27，40小时,接种量：200亿孢子/吨,二级种子,培养基：同上,培养条件：27、10-14小时,接种量：10%,质量要求,菌
9、丝长稠呈丝状、菌丝团少,青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，1-4为年青期，4-6期合成青霉素的能力最强,发酵工艺控制,微生物发酵过程可分为，分批，分批补料，半连续和连续等几种发酵方式。不同的发酵工艺方式各有其优缺点。,分批发酵,分批发酵：接种后成为准封闭系统，除了通气外没有别的物质交流。,微生物生长分为：停滞期、对数生长期、稳定期和死亡期,在停滞期，菌体没有分裂只有生长，因为当菌种接种入一个新的环境，细胞内的核酸、酶等稀释，这时细胞不能分裂。,分批发酵,当细胞内的与细胞分裂相关的物质浓度达到一定程度，细胞开始分裂，这时细胞生长很快，比生长速率几近常数。这个时期称为对数生长期,随着细胞生长，培
10、养液中的营养物减少，废物积累，导致细胞生长速率下降，进入减速期和稳定期。最后当细胞死亡速率大于生成速率，进入死亡期,二次生长曲线,分批培养各时期的影响因素和意义,菌种：繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短；接种物菌龄：用对数生长期的菌种接种时，其延迟期较短，甚至检查不到延迟期；接种量：一般来说，接种量增大可缩短甚至消除延迟期；培养基成分：1、在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上生长时短；2、接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。,影响延滞期长短的因素：,在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期；采取的缩短延滞期的措施有：1
11、、增加接种量；（群体优势-适应性增强）2、采用对数生长期的健壮菌种；3、调整培养基的成分，在种子培养基中加入发酵培养基的某些成分。4、选用繁殖快的菌种,对数期的应用意义,1、此时期的菌种比较健壮，增殖菌体的最适菌龄；生产上用作接种的最佳菌龄；2、发酵工业上应延长该期，以达到较高的菌体密度3、尽量使有害微生物不能进入此期4、是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等的良好材料。,稳定期的应用意义,发酵产物形成的重要时期（抗生素等），生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下：补充营养物质（补料）调pH 调整温度,代谢产物生成与微生物生长的关系,微生物发酵中，所消耗的底物主要用于3个方面：1、合成新
12、的细胞物质 2、合成代谢产物 3、提供能量 以细胞生长，产物合成和底物消耗的变化，可以画出不同状态下的菌种的代谢曲线。（分析关系，掌握规律，发现问题，改善工艺）,按产物的生成与微生物生长关系的动力学模式分为三种类型,(a)：相关联型，产物的形成速度与细胞的比生长速度成正比，因此要提高产物的形成速度就应当努力获得高的细胞的比生长速度(b)：部分关联模式：取决于有关联和无关联的两种形式。(c)：无关联模式：产物的形成速度与生长速度无关联，而只与细胞的浓度有关。,生长相关型,指产物的生产与细胞的生长密切相关，产物的生成是微生物主要能量代谢的直接结果。产物通常为细胞生长必须的初级代谢产物，如葡糖酸，单
13、细胞蛋白等,生长部分相关型,产物是能量代谢的间接结果，不是底物的直接氧化产物，产物的生成与细胞生长部分偶联。主要有柠檬酸、氨基酸发酵,非生长相关型,产物的生成与能量代谢没关系，与细胞生长也无直接关系，产物均为次级代谢产物，细胞进入稳定期后产物才开始大量合成。在基质消耗和菌体生长后，菌体利用中间代谢反应来形成产物。,分批培养的优缺点,优点：操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量容易掌握缺点：存在底物抑制或限制问题，对于底物类型及初始浓度敏感的次级代谢物就不适用，设备利用效率较低，产率不高。,分批发酵往往使用较丰富培养基，不能简单的用Monod方程来阐释，存在二次生长现象。,补料分批培养
14、,在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加。在工厂的实际生产中采用这种方法很多。,补料分批培养的优缺点,优点 在这样一种系统中可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以利用计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产工艺。,缺点 由于没有物料取出，产物的积累最终导致比生产速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌机会,半连续培养,在补料分批培养的基础上间歇放掉部分发酵液（带放）称为半连续培养。,优点 放掉部分发酵液，再补入部分料
15、液，使代谢有害物得以稀释有利于产物合成，提高了总产量。,缺点 损失了菌体和营养成分，提取的总体积增大，,连续培养,发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度都是恒定的。原理：当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。,常用的连续培养方法有：恒浊法恒化法可以在一定程度上，人为控制生长曲线中的某个时期，使之缩短或延长时间，使某个时期的细胞加速或降低代谢速率
16、，大大提高培养过程的人为可控性和效率,恒浊法 是以培养器中微生物细胞的密度为监控对象，用光电控制系统来控制流入培养器的新鲜培养液的流速，同时使培养器中的含有细胞与代谢产物的培养液也以基本恒定的流速流出，从而使培养器中的微生物在保持细胞密度基本恒定的条件下进行培养的一种连续培养方式。用于恒浊培养的培养装置称为恒浊器,用恒浊法连续培养微生物，可控制微生物在最高生长速率与最高细胞密度的水平上生长繁殖，达到高效率培养的目的。恒浊法特别适合于哪些类型的发酵生产？,恒化法是通过控制培养基中营养物，主要是生长限制因子的浓度，来调控微生物生长繁殖与代谢速度的连续培养方式。用于恒化培养的装置称为恒化器。恒化连续
17、培养在研究微生物利用某种底物进行代谢的规律方面被广泛采用。因此，它是微生物营养、生长、繁殖、代谢和基因表达与调控等基础与应用基础研究的重要技术手段。,恒浊器与恒化器的比较,多级连续发酵：将多个反应器串联起来，前一个反应器的出料作为下一个反应器的进料，即为多级连续发酵。利于使用不同的发酵条件和生成不同的产物。,反馈发酵：将连续发酵放出的培养液中的菌体经浓缩回收后，返回至原发酵罐内。利于节约菌体。在这种发酵中，菌浓越来越大，代谢产物维持较低水平。,连续发酵的优点：在发酵达到稳定后，其非生产时间大大减少，设备利用效率高，生产能力大，产品质量较稳定，工艺易于实现自动化，节约了大量人力物力水蒸气等。缺点：染杂菌和菌种退化，营养物利用率低于单批培养。,连续培养是不是能一直生产下去？,反馈抑制与反馈阻遏的区别分解代谢物阻遏的概念次级代谢的特点,
