生化药品生产技术.ppt

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1、2023/10/16,1,生化药品生产技术,1 生物药物 2 抗生素 3 生化药品 4 生物制品,你能区分以下概念吗？,生物制药及生物药物,生物制药：是利用生物体或生物过程在人为设定的条件下生产各种生物药物的技术。生物药物：是指运用生物学、医学、生物化学等的研究成果，利用生物体，生物组织、体液或其代谢产物（初级代谢产物和次级代谢产物），综合应用化学、生物技术、分离纯化工程和药学等学科的原理与方法加工、制成的一类用于预防，治疗和诊断疾病的物质。,生物药物的范畴：生物药物包括从动物、植物、海洋生物、微生物等生物原料制取的各种天然生物活性物质及其人工合成或半合成的天然物质类似物。因而生物药物涵盖了抗

2、生素、生化药品、生物制品等范畴。,生化药品,生化药物：是从生物体分离纯化所得的一类结构上十分接近于人体内的正常生理活性物质，具有调节人体生理功能，达到预防、治疗、诊断疾病，有目的地调节人体生理机能的生化物质。生化药品范畴：生化药品是维持生命正常活动的必需生化成分，包括氨基酸、多肽、蛋白质、多糖、核酸、脂肪、维生素、激素等。生化药品的特点：一是来源于生物体；二是人体的基本生化成分。因此在医疗应用中显示出高效、合理、毒副作用极小的临床效果，受到极大的重视。,生物制品,生物制品：是直接使用病源生物体及其代谢产物或以基因工程、细胞工程等技术制成的，主要用于人类感染性疾病的预防、诊断和治疗的制品。生物制

3、品的分类：根据所用材料分类分为：菌苗、噬菌体、疫苗、抗血清与抗毒素、类毒素、免疫调节剂（如胸腺肽、免疫核酸等）、诊断试剂、单克隆抗体、混合制剂、血液制品。根据用途分类：分为预防、治疗、诊断三大类。,第一节 生化药品分类,按药物的化学本质和化学特性分类氨基酸及其衍生物类多肽及蛋白质类酶类核酸及其降解物和衍生物糖类脂类,氨基酸及其衍生物,氨基酸是生命体重要的组成部分-蛋白质的基本组成单位，生命活动表现出各种生理功能，主要取决于蛋白质分子中的氨基酸的排列顺序以及形成特定的三维空间结构。,主要作用原理：根据以上描述，氨基酸类药物是治疗蛋白质代谢紊乱和缺乏所引起的一系列疾病的生化药，也是有高等营养价值的

4、蛋白质补充剂，有着广泛的生化作用和临床疗效。,多肽和蛋白质,多肽和蛋白质是生物体内广泛存在的重要生化物质，具有多种多样的生化功能。目前，多肽类生化药的发展正在朝着临床应用十分广泛和有效的道路前进。多肽类激素和活性肽都是细胞自制的、含调节生理和代谢效能的微量有机物，常用的氨基酸有20多种。如：胸腺素有40个肽，目前正在一个个的合成，除原料药胸腺素外，已逐步合成胸腺三、四、五、八、九、二十四肽等。,蛋白质是构成生物体的一类最重要的有机含氮化合物，是塑造一切细胞和组织的基本材料，是生命的物质基础。随着现代生物技术的深入发展，生命的奥秘已经逐步被揭开，用重组技术生产的蛋白质药物正以惊人的速度突飞猛进。

5、FDA已批准30多个重组药物，如insulin、rhGH、rTPA、干扰素-2a、-2b、a-N3、-1b、r、r-1b；EPO-a、；1L-2、GSF、GM-CSF2005年，全球为600多亿美元，从原占医药的4%迅速提高至11%。,酶与辅酶,酶是具有催化功能的蛋白酶。酶类药物是直接用酶的各种剂型以改变体内酶的活力或改变体内某些生理活性物质和代谢产物的数量等，从而达到治疗某些疾病的目的。,多糖,多糖是由单糖缩合而成的链状结构物质。在自然界中存在的多糖起结构作用或作为一种能量的储存形式而起重要作用，所有多糖都可被酸水解而产生单糖或单糖的衍生物。,核酸类药物,核酸是生命的物质基础，它不仅是携带各

6、种生物所特有的遗传信息，而且影响生物的蛋白质合成和脂肪、糖类的代谢。,除以上以天然的形式存在的外，尚有它们的类似物、衍生物或它们的聚合物亦均属于核苷类药物，主要在干扰抗肿瘤代谢、干扰抗病毒代谢、放射病、血小板减少症、白细胞减少症、急慢性肝炎、心脑血管、肌肉萎缩、代谢障碍等疾病中发挥作用。,脂质类,脂质是脂肪、类脂及其衍生物的总称。广泛存在于动物、植物、微生物等生物体中。该类药物的种类繁多，结构差异，性能差别很大。一般分：胆酸类、不饱和脂肪酸类、磷脂类、固醇类、色素类。故药理作用和临床应用各不相同。,图1.2005版药典生化药品品种规格标准比例图,按原料来源分类：有利于对不同原料进行综合利用、开

7、发研究。人体组织来源 动物组织来源 植物组织来源 微生物来源 海洋生物来源,第二节 生化药物特点,1、原材料复杂：同一种生化物质的原料可来源于不同生物体；同一种物质也可由同种生物体不同部位产生；同一种生物体或组织可产生结构完全不同的物质及结构相似物质。,胰岛素：猪、牛、人；菘蓝：板蓝根、大青叶；微生物：抗生素、蛋白质、酶等；,2、种类多、含量低,红豆杉紫杉醇含量0.003%，约从 38 000棵紫杉树中方可分离提纯得到 99纯度的紫杉醇约 25kg，2000美元/克,3、种属特性,4、活性与结构相关5、制备要求高,第三节 生化药物的制备,（一）生物药物原料的选择、预处理、与保存方法（二）生物药

8、物的提取（三）生物药物的分离纯化方法,天然生物材料制备生化药物的过程,一、生物材料的选择,1.来源 应选用来源丰富的材料，尽量不与其他产品争原料，最好能一物多用，综合利用。胰脏 制备弹性蛋白酶和激肽释放酶，胰岛素与胰酶等。,2.杂质情况,难于分离的杂质会增加工艺的复杂性，严重影响收率、质量和经济效益。植物SOD 血,3.有效成分的含量,（1）合适的生物品种：催乳素，哺乳动物（2）合适的组织器官：胃蛋白酶，胃（3）生物的生长期：胸腺素，幼龄动物（4）合适的种属：人，猪（5）合适的生理状态：胰岛素，饭后,生理活性物质易失活与降解，采集时必须保持材料的新鲜。防止腐败、变质与微生物污染。如胰脏采摘后要

9、立即速冻，防止胰岛素活力下降。保存生物材料的主要方法有速冻、冻干、有机溶剂脱水，制成丙酮粉，或浸存于丙酮与甘油中等。,二、生物材料的采集与保存,（一）组织与细胞的破碎物理法 化学法 生物法,三、生物材料预处理,1.物理法,（1）磨切法 工业：绞肉机，刨胰机，球磨机、磨粉机。实验室：匀浆机，研钵，高速组织捣碎机。（2）压力法 有压榨法、高压法和减压法，渗透压法。（3）超声波法（4）反复冻融法,超声细胞破碎仪 高压细胞破碎仪,2.化学法,用稀酸、稀碱、浓盐、有机溶剂或表面活性剂处理细胞，可破坏细胞结构释放出内容物。,（1）组织自溶法 利用组织中自身溶解酶的作用改变、破坏细胞结构，释放出目的物称为组

10、织自溶法。（2）酶解法 用外来酶处理生物材料，如用溶菌酶处理某些细菌，蜗牛酶等,3.生物法,（3）噬菌体法 用噬菌体感染细胞、裂解细胞，释放出内容物。,（二）细胞器的分离,为获得结合在细胞器上的一些生化成分或酶系，常常要先得到细胞器再进一步分离有效成分。方法是匀浆破碎细胞，差速离心。,（三）制备丙酮粉,亦称丙酮干制剂。是微生物或生物组织，有时是蛋白质，酶的提取物用丙酮脱水的干制品。这是防止生物物质在水的存在下发生破坏变质的一种保存方法，而另一方面，由于脂类物质的溶解作用，难以从生物材料中溶解分离的物质，也可以从这个制品中获得其溶液状态的产品。,提取是利用制备目的物的溶解特性，将目的物与细胞的固

11、形物成分或其它结合成分分离，使其由固相转入液相或从细胞生理状态转入特定溶液环境的过程。,三、生物活性物质的提取,（一）物质的性质与提取方法的选择,要取得好的提取效果，最重要的是要针对生物材料和目的物的性质选择合适的溶剂系统与提取条件。,其中最主要的是目的物与主要杂质在溶解度方面的差异以及它们的稳定性。操作者可根据文献资料及本人的试验摸索获得的有关信息，在提取过程中增加目的物的溶出度，尽可能减少杂质的溶出度。,（1）采用缓冲盐系统 在生物药物制备中，常用的缓冲盐有磷酸缓冲盐，柠檬酸缓冲盐，Tris缓冲液，醋酸缓冲盐，碳酸缓冲盐，硼酸缓冲盐和巴比妥缓冲盐等。,（二）活性物质的保护措施,（2）添加保

12、护剂,防止某些生理活性物质的活性基团及酶的活性中心受到破坏。巯基，极易被氧化，故提取时，常添加某些还原剂如半胱氨酸，巯基乙醇。对易受重金属影响的，可添加EDTA等螯合剂。,（3）抑制水解酶的作用：抑制剂、热等。（4）其它保护措施：冷、热、酸、碱,、温度 提取温度 溶解度。温度 物料的粘度，有利于分 子扩散和机械搅拌。对不耐热的生物活性物质的提取，一般在010进行提取。,（三）影响提取的因素,、酸碱度,多数生化物质在中性条件下较稳定，pH值一般应控制在49范围内，避免目的物的等电点。抑制有害酶类的水解破坏作用，防止降解，提高收率。,盐溶作用：盐离子作用于生物大分子表面，增加了表面电荷，使之极性增

13、加，水合作用增强，促使其形成稳定的双电层，此现象为盐溶作用。盐析作用：指溶液中加入无机盐类而使某种物质溶解度降低而析出的过程,、盐浓度,（四）提取方法,、用酸、碱、盐水溶液提取,、表面活性剂提取,表面活性剂分子兼有亲水与疏水基团，分布于油水界面时，有分散、乳化和增溶作用。表面活性剂分阴离子型、阳离子型与非离子型。离子型表面活性剂作用强，但是易引起蛋白质等生物大分子的变性，非离子表面活性剂变性作用小，适合于用水、盐系统无法提取的蛋白质或酶的提取。,溶剂提取法,相似相溶定律,固液提取,、有机溶剂提取,1、常用溶剂（按亲水性增加排列如下）：环己烷石油醚苯乙醚氯仿乙酸乙酯 正丁醇丙酮乙醇甲醇水。极性最

14、大的有机溶剂：甲醇 极性最小的有机溶剂：环己烷 溶解范围最广的有机溶剂：乙醇,溶剂选择与被提取成分对照表,2、溶剂选择的原则目标成分易溶，杂质成分难溶；惰性，不与目标成分反应，即使发生反应也应该属于可逆性的；经济、安全、后续操作容易进行。,溶解度,化学性质稳定,安全、价廉,液液萃取,液液萃取是利用溶质在两个互不混溶的溶剂中溶解度的差异，将溶质从一个溶剂相向另一个溶剂相转移的操作。,残留量计算公式,Xn=X0：目的物总量（）：分配系数，大，Xn大：溶剂体积（），大，Xn小，倍：生物材料重量（）：提取次数，大，Xn小，次,（一）盐析浓缩：硫酸铵沉淀蛋白质（二）有机溶剂沉淀浓缩 在生物大分子的水溶液

15、中，逐渐加入乙醇，丙酮等有机溶剂，可以使生化物质的溶解度明显降低，从溶液中沉淀出来。,四、生物活性物质的浓缩与干燥,（三）用葡聚糖凝胶（Sephadex）浓缩（四）用聚乙二醇透析浓缩（五）超滤浓缩（六）真空减压浓缩与薄膜浓缩 真空减压浓缩在药物生产中使用较为普遍，具有生产规模较大，蒸发温度较低，蒸发速度较快等优点。薄膜浓缩器的加速蒸发的原理是增加汽化表面积。,（七）干燥的目的：提高药物或药剂的稳定性，以利于保存和运输；达到规格标准；便于进一步处理。（八）干燥方法：减压干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等。,冷冻干燥机,、生物制药中分离制备方法的特点（1）生物材料组成非常复杂。一种生物材料常含成千上万成分

16、，各种化合物的形状、大小、分子量和理化性质都各不相同。没有固定操作方法。,五、生化物质的分离纯化方法,（2）有些化合物在生物材料中含量极微，只达万分之一，甚至百万分之一。因此，分离操作步骤多，不易获得高收率。,（3）生物活性物质离开生物体后，易变性，破坏，分离进程必须十分小心的保护这些化合物的生理活性。,（4）生物制药的分离方法几乎都在溶液中进行，各种参数（温度，pH，离子强度）对溶液中各种组分的综合影响常常无法固定，以致许多实验设计理论性不强。,（5）为了保护目的物的生理活性及结构上的完整性，生物制药中的分离方法多采用温和的逐级分离方法。亲和层析分离具有分离的专一性，高效性。,（6）生物产品

17、最后均一性的证明与化学纯度的概念不完全相同，因生物分子对环境反应十分敏感，结构与功能关系比较复杂。,、基本原理,（1）根据分子形状和大小不同进行分离：如差速离心与超离心、膜分离（透析，电渗析）与超滤，凝胶过滤法。,（2）根据分子电离性质的差异性进行分离。如离子交换法，电泳法，等电聚焦法。,（3）根据分子极性大小及溶解度不同进行分离。如溶剂提取法，逆流分配法，分配层析法，盐析法，等电点沉淀法，及有机溶剂分级沉淀法。,（4）根据物质吸附性质的不同进行分离。如选择性吸附法 吸附层析法。（5）根据配体特异性进行分离：亲和层析法。,、分离纯化的基本程序和实验设计,生物体内某一组分，特别是未知结构的组分的

18、分离制备设计大致上分为五个基本阶段。,（1）确定制备物的研究目的及建立相应的分析鉴定方法。（2）制备物理化性质稳定性的预备试验。（3）材料处理及抽提方法的选择。（4）分离纯化方法的摸索。（5）产物均一性测定。,分离纯化早期使用方法的选择 早期分离纯化用萃取，沉淀，吸附等一些分辨力低的方法较为有利，这些方法负荷能力大，分离量多兼有分离提纯和浓缩的作用，为进一步分离纯化创造良好的基础。,、分离纯化的策略：,各种分离纯化方法的使用程序 在相同或相似条件下连续使用同一种分离方法就不太适宜。在安排纯化方法顺序时，还要考虑到有利于减少工序，提高效率。（盐析吸附，吸附盐析）对于一未知物通过各种方法的交叉应用

19、，有助于进一步了解目的物的性质。,分离后期的保护性措施,在分离操作的后期必须注意避免产品的损失，主要损失途径是器皿的吸附，操作过程样品液体的残留，空气氧化和某些事先无法了解的因素。,、分离纯化方法步骤优劣的综合评价 分辨能力 重现性 回收率 比活性,离心技术,沉降作用悬浮液静置时，在重力作用下，密度大于周围溶液的固体颗粒逐渐下沉，称为沉降作用。离心技术在离心力场作用下，加速悬浮液中固体颗粒沉降速度的方法称为离心技术。相对离心力通常用离心力与重力的比值表示离心机的离心能力，也称分离因素，用符号g或g表示。,r为离心转子的半径距离，以cm为单位；g为地球重力加速度（980cm/sec2）；N为转子

20、每分钟的转数（rpm）。,离心机,1按转速高低来分（1）普通离心机，小于6000rpm（2）高速离心机，800025000rpm（3）超速离心机，2500080000rpm,2按工作性质分类（1）制备型离心机（2）实验室用离心机3按操作方式分类（1）连续离心机（2）人工卸料（出渣）离心机；（3）自动卸料离心机（如螺旋式离心机）,卧式螺旋卸料沉降离心机,膜分离技术,海水脱盐淡化医药工业的纯化水、注射用水生物大分子物质的浓缩与纯化人工肾透析过滤除菌（溶液、空气）,应用范 围,返回,凝胶层析 它是将样品化合物通过一定孔径的凝胶固定相，用于流经体积的差异，使不同分子量的组成得以分离的层析。,返回,离子

21、交换法是利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作方法。带电粒子与离子交换剂间的作用力是静电力。它们结合是可逆的，在一定条件下能够结合，条件改变后也能被释放出来。离子交换剂由惰性的不溶性载体，功能基团和平衡离子组成。,离子交换法,洗杂,洗脱,返回,固相析出分离法 改变溶液条件，使溶质以固体形式从溶液中分出的操作技术称为固相析出分离法。析出物为晶体时称为结晶；析出物为无定形固体称为沉淀法。固相析出法主要有盐析法，有机溶剂沉淀法，等电点沉淀法，结晶法等。,盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯

22、化目的的方法。,盐析的机制,高浓度的中性盐溶液中存在着大量的带电荷的盐离子，它们能够中和生物分子表面的电荷，使之赖以稳定的双电层受损，从而破坏分子外围的水化层；另外，大量盐离子自身的水合作用降低了自由水的浓度，从另一方面摧毁了水化层，使生物分子相互聚集而沉淀。,向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。,有机溶剂沉淀法,主要机理：（1)亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，使得溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。(2)水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。,

23、等电点沉淀法,两性电解质，在溶液pH处于等电点（pI）时分子表面净电荷为零，导致赖以稳定的双电层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加，溶解度降低。调节溶解的pH值，使两性溶质溶解度下降，析出沉淀的操作。,改变溶液的某些条件，使其中的溶质以结晶态析出的过程称作结晶。,结晶法,盐析结晶法,请在此键入您自己的内容,Cyt c,化学反应结晶法,吸附法 吸附是物质分子在两相界面上浓度的增加。我们称物质从流动性（气或液相）浓缩到固体表面从而达到分离的过程称为吸附作用。把在表面上能发生吸附作用的固体称为吸附剂；将被吸附的物质称为吸附物。,常用吸附剂：1)活性炭是一种吸附能力很强的非极性吸附剂，其吸附作用在水

24、溶液中最强，在有机溶剂中较弱，吸附能力的顺序：水乙醇甲醇乙酸乙酯丙酮氯仿。2)人造沸石人造沸石是一种人工合成的无机阳离子交换剂。用于细胞色素C的分离。,3)磷酸钙凝胶在蛋白质的分离、精制中，较为常用的吸附剂为磷酸钙凝胶。（羟基磷灰石）活性部位为钙离子。4)白陶土5)氢氧化铝凝胶用于蛋白质及酶的分离,6)氧化铝活性氧化铝是最常用的一种吸附剂，特别适于亲脂性成分的分离，广泛地用于在醇，酚，生物碱，染料，甾体化合物，苷类，氨基酸，蛋白质以及维生素等物质的分离。7)硅胶最常用,8)滑石粉 惰性 助滤剂9)硅藻土 惰性 助滤剂10)皂土11)聚酰胺粉12)大孔网格聚合物吸附树脂 极性，弱极性，非极性大孔

25、吸附树脂强酸性，弱酸性，强碱性，弱碱性等,返回,利用生物大分子特异性亲和力而设计的层析技术称为亲核层析。在亲和层析中起可逆结合的特异性物质称为配基（Ligand），与配基结合的层析介质称为载体（Matrix）,亲和层析,亲和层析的过程：,1)配基固定化 选择合适的配基与不溶性的支撑载体偶联，或共价结合成具有特异性亲和性分离介质。,2)吸附样品 亲和层析介质选择性吸附酶或其它生物活性物质，杂质与层析间没有亲和作用，故不能被吸附而被洗涤去除。,3)样品洗脱 选择适宜的条件使被吸附的亲和介质上的酶或其它生物活性物质洗脱。,配基固定化,吸附样品,样品洗脱,制备型高效液相色谱制备型HPLC技术是利用大直

26、径柱，分离制备大量纯物质（0.1g）HPLC的分离依据是样品中各组分之间带电性，极性，疏水性，分子大小，等电点，亲和性，螯合性等理化性质的差异。,过程,将样品导入柱头，流动相在高压泵的作用下，其流量被准确地控制通过色谱柱，样品中各组分在色谱柱中形成差速迁移，按时间先后流出层析柱，然后进行检测和分部收集。,色谱数据处理 检测器,按固定相对样品的保留机理，HPLC大致可分为液固色谱，离子交换色谱，凝胶色谱，疏水色谱，亲和色谱，金属螯合亲和色谱等。色谱重要参数：分离度，分离速度，回收率，样品容量。,分离度Rs理论塔板数N容量因子K为溶质在固定相中得总摩尔数与流动相中得总摩尔数之比。选择因子,t0,tR1,tR2,返回,本章总结,掌握生化药物定义及类别熟悉生化药物的传统制备工艺了解生化药物生产常用分离纯化方法掌握生化药物的特点,谢谢！再见！,