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1、第四节 基因药物,一、基因治疗的概念1、基因治疗的定义:(P632页)基因治疗是将人的正常基因或有治疗作用的基因导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。而用于基因治疗的核酸等称为基因药物（gene medicines）,在未形成概念前，20世纪70年代就开始临床实验，由于实验未取得成果，而且没有得到NIH的批准，广受抨击。80年代，在动物身上进行了大量试验，为其临床应用奠定了基础。1990年9月，临床实验正式开始。患者是一名患严重联合免疫缺陷症的年轻姑娘，她从父母处各继承了一个缺陷的ada基因，造成体内缺乏腺苷酸脱氨酶。我国复旦大学的薛京伦研究小组，
2、做了世界上首例血友病 基因治疗。,成功地对先天性重症免疫缺陷症进行基因治疗的法国基因治疗组组长艾伦费希尔博士（左）和成员玛丽娜卡巴甘那卡勃博士（右）。,2002年10月,一名法国男孩在接受试验性基因治疗后罹患白血病，而基因治疗很可能是白血病发病的原因。Fisher说，他非常希望这种基因治疗方法从总体而言利大于弊。除基因治疗之外，治疗SCID的另一种治疗方法是近亲的骨髓移植。除非骨髓移植非常匹配，否则手术的失败率是25%。他强调说，这一失败率比现在接受基因治疗的11例患者的并发症发生率高2倍以上。,从基因角度：对缺陷的基因进行原位修复用正常有功能的基因置换有缺陷的基因增补缺陷基因（不需要去除异常
3、基因，而是另外转入与缺陷基因同源的有功能的基因来弥补缺陷的基因）,从治疗角度导入基因以改变患者细胞的基因表达导入基因：缺陷基因相对应的有功能的同源基因缺陷基因无关的治疗基因,基因治疗的两种形式,体细胞基因治疗种系基因治疗,只限于某一体细胞的基因的改变只限于某个体的当代对缺陷的生殖细胞进行矫正当代及子代,2、基因治疗的方式,基因矫正或置换基因增补基因封闭其他,3、导入的方式,体外导入（ex vivo）体外将基因导入细胞内再将这种基因修饰过的细胞回输病人体内使这种带外源基因的细胞在体内表达达到治疗或预防的目的,体内导入（in vivo）外源基因直接导入体内有关的组织细胞使其进入相应的细胞并表达,基
4、因治疗的基本程序,治疗性基因的选择,基因载体的选择,病毒载体非病毒载体,靶细胞的选择,体细胞生殖细胞,基因转移,间接体内疗法直接体内疗法,外源基因表达的筛选 利用载体中的标记基因,回输体内,目前临床试验的治疗基因：合适的能达到治疗/预防的目的基因的cDNA 目的基因的cDNA的获得cDNA文库中目的基因的克隆人工合成基因片段PCR法筛选扩增目的基因,二、治疗的基因的选择,三、载体系统-运送基因的工具,病毒载体非病毒载体,逆转录病毒载体腺病毒腺相关病毒单纯胞疹病毒哺乳动物人工染色体脂质体裸DNA基因缝合线法,逆转录病毒载体,逆转录病毒的生活周期进入宿主细胞 双链RNA 逆转录酶 双链DNA前病毒
5、 整合到宿主细胞基因组DNA中 宿主细胞RNA聚合酶II mRNA 病毒RNA基因组 作为合成相应 病毒蛋白质的模板 包装成新的病毒颗粒，离开宿主,逆转录病毒载体的构建,长末端重复序列,包装信号,LTR,gag,pol,env,LTR,调节和启动转录,产生病毒核心蛋白,产生逆转录酶,产生病毒外膜蛋白,包装信号,LTR,目的基因,标记基因,LTR,逆转录病毒基因组的一般结构,重组逆转录病毒载体,假病毒颗粒的产生,病毒复制需要的gag，pol，env基因已经预先整合进包装细胞的基因组,腺病毒DNA 载体的特点 基因重排低 外源基因于病毒DNA重组后能稳定复制几个周期 安全性能好 不整合人的染色体D
6、NA，不会导致恶性肿瘤 宿主范围广 对受体细胞是否处于分裂期要求不严格 使用效果好 外源基因在载体上容易高效表达,3、腺相关病毒（adeno associated virus，AAV）属于细小病毒科，其成熟病毒颗粒中有的含正链DNA，有的含负链DNA。不能独立繁殖，其繁殖依赖于辅助病毒（腺病毒或疱疹病毒）。基因组仅5kb，有两个ORF，5和3端各有一个由145个氨基酸组成的反向重复序列（ITR），对病毒的复制、整合、包装等有重要调控作用。,优点：1)、反向末端重复序列中没有转录调控元件，减少激活原癌基因的可能性2）、宿主广，只能形成慢性感染3）、可发生位点特异性整合，有利于表达4）、热稳定性好
7、，而作为辅助病毒的腺病毒在60即被灭活5）、安全性较好，本身不致病,4、单纯疱疹病毒（herpes simple virus，HSV）双链DNA病毒，基因组大小152kb，可缺失多个基因仍保持复制能力。特点：1）、序列清楚 2）、可容纳至少30kb外源基因3）、宿主广，可侵染脊椎动物各种细胞4）、重组病毒培养过程中易得到较高滴度5）、从外周进入神经系统，不影响神经元功能 但表达产物对多种类型宿主有毒性，且可引起严重免疫反应，要进入临床仍需改进,5、痘病毒载体 痘苗病毒为线形双链的有包膜病毒,其核心颗粒不依赖宿主细胞而独立引进转录和复制,宿主范围广泛，易于培养；痘苗病毒基因组中大量非必需基因的缺
8、乏并不影响其在宿主细胞的复制能力,可允许在同一或不同非必需区插入多个基因 痘苗病毒缺点是载体对细胞的毒性,同时病毒能被人体的补体系统灭活并降解,表 常用病毒载体得特征和适用范围,四、靶细胞,1、造血细胞 常用反转录病毒，体外基因转移，弥散的组织多，分散广。对转入外源基因的细胞可检验，考虑安全性及有效性。2、肌肉细胞 常用。肌肉细胞分布广，含量丰富，为“永久性”细胞，基因不会因分裂而丢失；细胞长而大，且为多核细胞，基因易转移和表达。为“非生命”器官，安全；溶酶体少，外源DNA不易被降解，基因存活时间长；血流丰富，产物可释放入血,3、皮肤 表皮涂抹或肤内注射裸露DNA活脂质体包裹DNA。安全、简便
9、，易行，但皮肤不断更替。4、其他 如肝细胞、静脉注射等。,五、转移方法,1、化学法DNA介导：用磷酸钙微量沉淀外源DNA，然后与靶细胞混合。染色体介导：用秋水仙素处理使染色体固缩，破碎，差速离心，分离出染色体，与受体细胞混合。脂质体介导：临床已用受体介导：外源DNA与某些细胞特异性受体的多肽配基形成复合物，与受体结合进入细胞,2、物理法直接注射法，显微注射法，电穿透法等3、病毒介导目前最常用和最成熟的方法,六、基因治疗的临床试验,当前基因治疗试验：治疗性试验基因标记非治疗性试验,治疗性试验,1、遗传性疾病2、恶性肿瘤（1）抑癌基因或细胞因子基因治疗（2）自杀基因系统（3）抑制血管生成（4）反义
10、药物（5）导入MHCI类抗原基因（6）导入MDR1(Multidrug Resistance)基因3、病毒性感染4、其他,遗传性单基因疾病,腺苷脱氨酶(ADA)缺乏的严重联合免疫缺陷(SCID),腺苷脱氨酶(ADA)缺乏的严重联合免疫缺陷(SCID),第一个基因临床治疗的方案(1990.9.14,NIH),病因:淋巴细胞缺乏ADA酶 腺苷、dATP堆积 破坏免疫功能 患儿很少活到成年,治疗策略：淋巴细胞ADA酶 恢复至正常水平的 5%-10%维持免疫系统功能 改善病人症状,治疗基本步骤:,ADA基因+逆转录病毒载体 导入患者淋巴细胞 体外扩增 回输病人体内淋巴细胞ADA酶恢复至正常水平的5%-
11、10%维持免疫系统功能,改善病人症状,恶性肿瘤的细胞因子基因治疗,基因工程“瘤苗”,策略a：将刺激免疫反应的细胞因子基因(IL-2/IL-12/IFN-)转导肿瘤细胞，提高肿瘤细胞的免疫原性转导细胞因子基因的肿瘤细胞在体内持续分泌细胞因子增强抗肿瘤的免疫反应，形成局部的抗肿瘤免疫微环境引发全身的抗肿瘤免疫机能,策略b：引入抑瘤基因，如p53基因 今又生（Gendicine）是世界上第一个获得批准临床使用的抗肿瘤基因药，由正常人肿瘤抑制基因p53和改构的5型腺病毒基因重组而成。通常判断一个抗癌基因必须同时具备以下条件：1、在该肿瘤中该基因发生了变化，包括突变、缺失、甲基化等。2、将该基因的野生型
12、导入肿瘤细胞能够部分或全部抑制其表型。3、该基因在该肿瘤相应的正常组织中存在正常表达。,P53结构示意图,P53基因产物是一种核磷酸化蛋白，能够与8种以上细胞蛋白结合，生物学活性是引起细胞周期阻滞，诱导凋亡和细胞分化。大约50%的人类肿瘤中存在p53基因的变化,The H2 alpha helix,shown in gold and comprised of residues 278-286,is thought to be a key component of of the DNA binding domain with its numerous charged residues,helpi
13、ng to bind to the major groove of the DNA molecule.,自杀基因,将一基因转入细胞，它编码的蛋白可将无毒的前药转变为有毒的物质 如胸苷激酶基因（tk），利用tk治疗脑瘤的实验于1992年经FDA批准应用于临床，10名接受治疗的患者，有6名至今仍活着。,Endostatin an angiogenesis inhibitor,Endostatin 是型胶 原C-末端的184个氨基酸 片段,具有抑制血管生成 的作用。重组鼠 Endostatin 可 以完全抑制小鼠肿瘤细胞 的生长,并且不产生耐药 性,经过几轮给药后小鼠 的肿瘤被治愈。,Endostatin 的结构与抑瘤效果,
