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1、生物化学Biochemistry,Ch1.蛋白质protein,蛋白质Protein,Protein是由多种氨基酸按一定序列通过肽键（酰胺键）缩合形成的生物大分子，生命体体内的大部分活动需要蛋白质参与。蛋白质是生物化学最早被研究的物质之一，尽管现在已经了解了蛋白质是mRNA经翻译指导组装而成，但其中的数量关系、组装后蛋白质的复杂修饰、亚细胞定位或迁移、蛋白质-蛋白质互动都不是基因水平解释的，因此，对蛋白质本质的研究，依然是生物化学中充满活力，引人关注的领域。,2.1蛋白质的分类,The classification of protein,2.1 蛋白质的分类THE CLASSIFICATION
2、 OF PROTEIN,蛋白质的主要组成是C、H、O、N、S，有些蛋白质也含有微量的P、Fe、Cu、I、Zn、Mo等元素，其中N含量最稳定，可据此对样本无机化后，再进行总氮含量及无机氮含量凯氏定氮法测定，计算进行蛋白质含量的测定：,蛋白质含量=（总氮含量-无机氮含量）6.25,三聚氰胺、皮革奶事件,课本所提供的蛋白质分类法,2.1.1 根据分子形状分类2.1.2 根据分子组成分类2.1.3 根据功能分类,2.1.1 根据分子形状分类,球状蛋白质 接近球形，水溶性好，行使多种生物学功能纤维状蛋白质 分子形状呈棒状或纤维状，大多不溶于水，生物体的重要构件或对生物体其保护作用，如胶原蛋白、角蛋白；与
3、运动有关的肌球蛋白；有些可溶水如血纤维蛋白原；有些纤维状蛋白质是由球蛋白聚集形成；膜蛋白质 一般折叠为近球形插入生物膜，也可通过共价或非共价键结合于生物膜表面，生物膜功能大多由膜蛋白实现。,膜结合质子泵蛋白是由多个亚基组成，插在质膜上，两头接露出膜，有一个ATP结合区（获得能量），透膜的亚基形成质子通道。,2.1.2 根据分子组成分类,简单蛋白质simple protein 仅有肽链组成，不包含其他辅助成分的蛋白质称简单蛋白质simple protein结合蛋白质conjugated protein 结合蛋白质又称缀合蛋白质。由简单蛋白质和辅助成分组成，其辅助成分成为辅基，根据辅基类别结合蛋白
4、质分为五类：核蛋白neucleoprotein糖蛋白与蛋白聚糖glucorprotein and proteoglycan脂蛋白lipoprotein色蛋白chromoprotein磷蛋白phosphoprotein,简单蛋白质的分类,核蛋白neucleoprotein,细胞核中核蛋白由DNA与组蛋白结合而成，核糖体是RNA与蛋白质组成的核蛋白，现在已知的病毒都是核蛋白。,根据结合蛋白的不同进行的蛋白质分类,糖蛋白及蛋白聚糖glucoprotein and proteoglycan,均有蛋白与糖以共价键相结合。具有催化作用的酶；运载蛋白；抗体、激素、血型物质；结构蛋白；膜蛋白糖蛋白：短寡糖链无
5、二糖重复单位单位 广泛存在动植物组织中，结缔组织和细胞间质的特有成分，组织细胞间的天然粘合剂,脂蛋白lipoprotein,是由蛋白质和脂质通过非共价键相连有膜蛋白及动物血浆脂蛋白不同的生物膜蛋白间功能形态都有很大差异血浆脂蛋白质为血液中运输脂质的运输蛋白，运载三酰甘油、胆固醇、磷脂等。按照三酰甘油含量的多少密度有所区别，分为乳糜微粒、极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白4类,脂蛋白含量与冠心病、动脉粥样硬化的关系,按密度可将血液中的运载脂蛋白分为乳糜微粒（chy-lomicron;CM）、极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein;VLDL)、低密度脂蛋白
6、(low density lipoprotein;LDL)、高密度脂蛋白（high density lipoprotein;HDL）四类。低密度和高密度脂蛋白的含量是一对二。两者都有重要任务：低密度脂蛋白把胆固醇从肝脏运送到全身组织，高密度脂蛋白将各组织的胆固醇送回肝脏代谢。当低密度脂蛋白，尤其是氧化修饰的低密度脂蛋白（OX-LDL）过量时它携带的胆固醇便积存在动脉壁上，久了容易引起动脉硬化。,色蛋白chromoprotein,由蛋白质与色素组成，血红蛋白质作为代表。血红素由珠蛋白和血红素组成，血红素是由原卟（porphyrin）啉与一个而家铁原子构成的化合物。除此以外，过氧化氢酶，细胞色素c
7、都是有蛋白质和铁卟啉组成的。从水母(Aequorea victoria)体内发现的发光蛋白。分子质量为26kDa，由238个氨基酸构成，第6567位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因。,绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP,有了这些荧光蛋白，科学家们就好像在细胞内装上了“摄像头”，得以实时监测各种病毒“为非作歹”的过程。通过沙尔菲的基因克隆思路，科学家们还培育出了多
8、种荧光生物，由于沙尔菲与钱永健的突出贡献，他们与绿色荧光蛋白的发现者下村修共享了今年的诺贝尔化学奖。,磷蛋白phosporprotein,由蛋白质和磷酸组成，磷酸往往与丝氨酸或苏氨酸侧链羟基结合，如胃蛋白酶、酪蛋白。蛋白质磷酸化和脱磷酸是对其机能进行调控的重要途径。磷酸化(由激酶催化)和去磷酸化(由磷酸酶催化)是控制细胞周期的关键。它们都被用来控制调控途径自身活性和执行调控途径决定的底物活性。细胞周期调控途径由一系列激酶和磷酸酶组成，它们通过将途径的下一个底物磷酸化和去磷酸化而对外来信号和检验点做出反应。途径最终显示的是通过控制M 期激酶(或S 期激酶)的磷酸化状态决定其活性。,2.1.3 根
9、据功能分类,酶调节蛋白质贮存蛋白质转运蛋白质运动蛋白质防御蛋白质与毒蛋白质受体蛋白质支架蛋白结构蛋白异常功能,关于分类,当我们对蛋白质并没有真正的了解之前，来对这些分类有充分的认识是很难的，这些分类也显得生硬而难以记忆。然而当我们学习了蛋白质、乃至整个生物化学的内容再返回来看蛋白质的分类，就会真正认识书中所提出的蛋白质分类所基于的理由，这些理由是否合理。,2.2 蛋白质的组成单位氨基酸,The unit of protein amino acid,2.2 氨基酸AMINO ACID,蛋白质水解得到氨基酸，说明氨基酸是蛋白质的基本组成单位。,氨基酸的结构,羧酸基：carboxylic acid
10、group氨基：amino group侧链:side chain,除了侧链为氢原子的甘氨酸外，所有的-碳原子皆为手性，故氨基酸具有旋光性。都由D型和L型，一般蛋白质水解得到的皆为L型，图示为L型。,Except glycine,all of the standard amino acid have four different groups arranged tetrahedrally around the C atom,几种简单化学基团名称,羟基,羰基,羧基,氨基,巯基,2.2.2 氨基酸的分类classification of amino acid,常见氨基酸有20种，其英文简写可用单字母
11、和三字母两种表示。根据氨基酸R侧链的极性以及中性电荷下的带电荷的情况分为4类：,2.2.2 氨基酸的分类classification of amino acid,非极性氨基酸（疏水氨基酸）8种：丙氨酸（Ala）缬氨酸（Val）亮氨酸（Leu）异亮氨酸（Ile）脯氨酸（Pro）甲硫氨酸（Met）苯丙氨酸（Phe）色氨酸（Trp）极性不带电荷：7种甘氨酸（Gly）丝氨酸（Ser）苏氨酸（Thr）半胱氨酸（Cys）酪氨酸（Tyr）天冬酰胺（Asn）谷氨酰胺（Gln）极性带正电荷的氨基酸（碱性氨基酸）3种 赖氨酸（Lys）精氨酸（Arg）组氨酸（His）极性带负电荷的氨基酸（酸性氨基酸）2种 天冬氨酸
12、（Asp）谷氨酸（Glu）,2.2.2 氨基酸的分类classification of amino acid,极性带正电荷氨基酸在pH值中性条件下带净负电荷，可与金属离子结合，故许多蛋白质结构中均需依赖这两种氨基酸形成金属结合位点。极性带负电荷氨基酸在中性pH条件下可接受质子，组氨酸是R基pKa值为7附近时唯一的氨基酸，故作为酶促反应质子供受体有重要作用，含有组氨酸的肽具有重要的生物缓冲功能。,必需氨基酸（essential amino acid）：,必需氨基酸（essential amino acid）：指人体（或其它脊椎动物）不能合成或合成速度远不适应机体的需要，必需由食物蛋白供给，这些氨
13、基酸称为必需氨基酸。成人必需氨基酸的需要量约为蛋白质需要量的20%37%。皮革奶就算不含毒也不可食用，因为添加的蛋白质不含人体必须氨基酸，无法满足正常的人体需要。最近国家开始禁止使用面粉增白剂。,2.2.2 氨基酸的分类classification of amino acid,不常见的氨基酸：通常由常见氨基酸修饰形成，在特定的位置其特定作用，如焦谷氨酸存在细胞紫膜质中，是光驱动质子泵蛋白质的成分。1986年以前，人们一直认为，出现在蛋白质分子中的由遗传密码编码的标准氨基酸残基只有20种。到了1986年，科学家们终于在含硒蛋白中发现第二十一种标准氨基酸含硒半胱氨酸。时隔16年之后，来自美国俄亥俄
14、州立大学的两个研究小组在产甲烷细菌里发现了第二十二种标准氨基酸吡咯赖氨酸。非蛋白质氨基酸,2.2.3 氨基酸理化性质physicochemical property,两性解离和等电点 无机盐一般为离子化合物，熔点高，能溶于水而不溶于有机溶剂，氨基酸具有这两个性质，因此推断氨基酸也是离子化合物。氨基酸是两性电解质（zwitterion），也叫偶极离子或两性离子。氨基酸本身的氨基与羧基作用也能成盐，称为内盐。,Ionizaton离子化,The-amino and-carboxyl groups on amino acids act as acid-base groups,donating or a
15、ccepting a proton as the pH is altered.At low pH,both groups are fully protonated,as the pH is increased two group loses a hydrogen ion.amino acid with an ionizable side-chain have an additional acid acid-base group with a distinctive pK.,等电点isoelectric point:pI,调节氨基酸溶液的pH，使氨基酸分子上的-NH3-和-COO-,即氨基酸所带
16、净电荷为零，主要以两性离子存在时，在电场中不向任何一极移动，此时pH叫做氨基酸的等电点（isoelectric point）。,氨基酸等电点的计算,公式：pH=(pKn+pKn+1)/2n:氨基酸（或多肽）完全质子化时带正电荷基团数pK:解离基团的解离常数电点的计算步骤 按氨基酸/多肽可解离基团的pK值自小到大按顺序排列 判断n值 判断氨基酸的分类 酸性氨基酸和中性氨基酸的完全质子化数=1 碱性氨基酸的完全质子化数=2,等电点的应用-电泳(electrophoresis),电泳electrophoresis：带电颗粒在电场中移动的现象称为电泳应用-氨基酸的分离与分析氨基酸不同（pI不同，大小不
17、同），在电场中泳动速度不同，因此可以通过电泳将氨基酸彼此分开当pH=pI时，氨基酸呈兼性离子，在电场中不移动当pHpI时，氨基酸带负电荷，在电场中向正极移动当pHpI时，氨基酸带正电荷，在电场中向负极移动意义凡是带电颗粒均可通过电泳加以分离电泳技术是生化常用分析技术,电泳技术介绍,移动界面电泳moving boundary elec-trophoresis 是将被分离的离子（如阴离子）混合物置于电泳槽的一端（如负极），在电泳开始前，样品与载体电解质有清晰的界面。电泳开始后，带电粒子向另一极（正极）移动，泳动速度最快的离子走在最前面，其他离子依电极速度快慢顺序排列，形成不同的区带。只有第一个区带
18、的界面是清晰的，达到完全分离，其中含有电泳速度最快的离子，其他大部分区带重叠。,区带电泳zonal electrophoresis;ZE 是在一定的支持物上，于均一的载体电解质中，将样品加在中部位置，在电场作用下，样品中带正或负电荷的离子分别向负或正极以不同速度移动，分离成一个个彼此隔开的区带。区带电泳按支持物的物理性状不同，又可分为纸和其他纤维膜电泳、粉末电泳、凝胶电泳与丝线电泳。,电泳技术介绍,等电聚焦电泳Isoelectric fo-cusing electrophoresis是将两性电解质加入盛有pH梯度缓冲液的电泳槽中，当其处在低于其本身等电点的环境中则带正电荷，向负极移动；若其处在
19、高于其本身等电点的环境中，则带负电向正极移动。当泳动到其自身特有的等电点时，其净电荷为零，泳动速度下降到零，具有不同等电点的物质最后聚焦在各自等电点位置，形成一个个清晰的区带，分辨率极高。,电泳技术介绍,等速电泳Isotachophoresis 是在样品中加有领先离子（其迁移率比所有被分离离子的大）和终末离子（其迁移率比所有被分离离子的小），样品加在领先离子和终末离子之间，在外电场作用下，各离子进行移动，经过一段时间电泳后，达到完全分离。被分离的各离子的区带按迁移率大小依序排列在领先离子与终末离子的区带之间。由于没有加入适当的支持电解质来载带电流，所得到的区带是相互连接的（图d），且因“自身校
20、正”效应，界面是清晰的，这是与区带电泳不同之处。,电泳技术介绍,2.2.3 氨基酸理化性质physicochemical property,氨基酸的化学性质与水合茚三酮反应与甲醛反应与2，4-而硝基氟苯反应与异硫氰酸苯酯反应与亚硝酸反应与荧光胺反应,与水合茚三酮反应ninhydrin reactions,除了Pro（脯氨酸）和羟脯氨酸（hydroxyproline）与茚三酮反应产生黄色物质，其余的-氨基酸与茚三酮反应均生成蓝紫色物质,该反应常用于指纹检验,与甲醛formaldehyde反应,氨基酸羧基pK值为，氨基pK值为，相差较大故滴定难以测定氨基或羧基解离情况，甲醛与氨基发生加成反应生成N
21、,N-二羟甲基氨基酸（dimethylol amino acid），使氨基pK值下降2-3个pH单位，此时可用酚酞做指示剂NaOH滴定。用于判断蛋白质水解或合成的进度。,与2，4-二硝基氟苯（dinitrofluorobenzene DNFB）反应,桑格尔末端氨基酸分析法：在极温和的条件下与多肽分子中一端的游离氨基作用，再将生成的DNP肽衍生物进行酸水解，就得到黄色的DNP和末端氨基酸构成的衍生物（即DNPX-氨基酸），后者和其他混合氨基酸分开后用纸上色谱法加以鉴定，就可以确定是哪一种氨基酸。,近年更多使用5-二甲氨基萘磺酰胺（DNS-Cl）,与异硫氰酸苯酯（phenyl isothiocya
22、nate PITC）反应,与亚硝酸反应,与荧光胺反应,2.3 肽,Peptide,2.3.1 肽的结构struture of peptide,肽键（酰胺键）,2.3.1 肽的结构struture of peptide,用x射线衍射法研究模型肽并测定键长和键角，肽键的C和N均为sp2杂化，C和N的三个共价键均处于同一平面，键角均接近120，C-N键唱0.133nm小于一般的0.145nm，大于C=N的0.125nm，因此，肽键具有约40%的双键性质。（稳定）酰胺键相关6个原子处于同一平面，成为肽平面（plannar unit of peptide）或酰胺平面。手性碳原子与肽键相连的部分可以旋转。
23、pH014范围内肽基无明显得失,2.3.1 肽的结构struture of peptide,肽链写法和读法,2.3.2 生物活性肽的功能function of BAP,生物活性肽biological acive peptide,BAP概念介绍几种,2.3.2 生物活性肽的功能function of BAP,谷胱甘肽,2.3.2 生物活性肽的功能function of BAP,催产素和加压素,2.3.2 生物活性肽的功能function of BAP,促肾上腺皮质激素,2.3.2 生物活性肽的功能function of BAP,脑肽,2.3.2 生物活性肽的功能function of BAP,胰
24、高血糖素,2.3.2 生物活性肽的功能function of BAP,胃肠道活性肽,2.3.3 活性肽的来源orign of BAP,1.体内途径2.体外途径分离纯化化学制备生物合成制备酶法水解,2.3.4 活性肽的应用,2.4 蛋白质的结构,Structure of protein,前面已经介绍了肽键和一些简单的多肽，在此基础上介绍蛋白质，蛋白质与多肽最大的区别是其空间结构，空间结构在蛋白质功能中起到关键作用。,2.4.1 蛋白质的一级结构 primary structure,介绍一些胰岛素（简单）,2.4.2 蛋白质的空间结构space structure,蛋白子的高级构象，假设是一根线可
25、以绕成团，可以揉在一起，可以长长铺开研究方法：x射线衍射法测定原子间距（结晶）；核磁共振（溶液）；圆二色性、紫外差光谱、荧光、荧光偏振结构层次：二级、超二级、结构域、三级、四级,2.4.2 蛋白质的空间结构space structure,作用力：共价键决定一级结构，空间结构主要是由次级键，疏水作用、范德华力决定，酰胺键的刚性、r基团之间的相互作用决定了构象特征,2.4.2 蛋白质的空间结构space structure,氢键,2.4.2 蛋白质的空间结构space structure,盐键,2.4.2 蛋白质的空间结构space structure,疏水作用力,2.4.2 蛋白质的空间结构sp
26、ace structure,范德华力,2.4.2 蛋白质的空间结构space structure,二级结构特征螺旋折叠转角无规则卷曲,2.4.2 蛋白质的空间结构space structure,超二级结构结构域,2.4.2 蛋白质的空间结构space structure,三级结构 肌红蛋白蛋白作为例子,2.4.2 蛋白质的空间结构space structure,四级结构,2.4.2 蛋白质的空间结构space structure,蛋白子的高级构象，一根线可以绕成团，可以揉在一起，可以长长铺开研究方法：x射线衍射法测定原子间距（结晶）；核磁共振（溶液）；圆二色性、紫外差光谱、荧光、荧光偏振结构层
27、次：二级、超二级、结构域、三级、四级,2.5 蛋白质结构和功能的关系,Function related to structure,2.5.1 蛋白质一级结构与功能的关系,种属差异,2.5.1 蛋白质一级结构与功能的关系,分子病,2.5.2 蛋白质构像与功能的关系,以血红蛋白、肌红蛋白不同的氧结合能力说明，别构效应,抗体识别的空间结构原理,2.6 蛋白质的性质与分离、分析技术,The separation and analysis techniques for protein and their physicochemical property,2.6.1 蛋白质的性质,相对分子质量两性电离和等
28、电点蛋白质的变性蛋白质的胶体性质蛋白质的沉淀反应蛋白质的颜色反应蛋白质的含量测定,2.6.2 蛋白质的分离和分析技术（不同技术受到条件制约）,根据蛋白质溶解度进行分离盐析等电点沉淀法低温有机溶剂沉淀法,2.6.2 蛋白质的分离和分析技术,根据蛋白质分子大小进行分离透析与超滤凝胶过滤法,2.6.2 蛋白质的分离和分析技术,根据蛋白质带电性质进行分离电泳法离子交换层析柱法,2.6.2 蛋白质的分离和分析技术,根据配体特异性进行分离亲和层析法,2.6.3 蛋白质分子中氨基酸序列的确定,多肽链的分离二硫键的断链氨基酸组成的分析N-末端残基的鉴定C-末端残基的鉴定多肽链的裂解肽段氨基酸序列的测定肽段的拼接二硫桥位置的确定,结语,
