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1、1,生物化学与分子生物学系 陈瑜,RNA组学,RNomics,2,1953年 DNA双螺旋结构的解析掀起了在 RNA转录和翻译水平解读遗传信息的高潮,导致mRNA,tRNA和rRNA的发现以及遗传密码和“中心法则”的建立.1977 年分裂基因(split gene)的发现极大地促进了在 RNA 转录后加工水平解读遗传信息表达的过程及机制,深入解析了mRNA,snRNA,snoRNA 和 gRNA 的结构与功能,提出了RNA 剪接、编辑以及核酶(ribozyme)和“RNA世界”等新的概念.,3,Central Dogma of Biology,4,Genotype to Phenotype,5
2、,随着基因组与基因组学这两个术语的流行，一系列新的术语也被创造出来，每个新的研究领域被冠以“组学”（-omic)的名称，而被研究的对象则被称为“组”（-ome)。其中最常用的：,6,美国科学杂志在2000年12月介绍2000年重大科学成就时,把人类基因组工作草图绘制工作排在第一位。介绍了生命可能始于RNA而非DNA，这方面的研究取得了突破性进展。国外在2000年底提出了RNA组学。如果说基因组学研究正全力构筑生命科学基石的话，那么RNA组学研究则是它不可缺少的同盟军。,7,传统观念认为：三类最重要的生物高分子化合物中，DNA携带遗传信息，蛋白质是生物功能分子，而RNA在这二者间起传递遗传信息功
3、能（即参与蛋白质的生物合成）。20世纪80年代初，TCech发现RNA也可成为生物催化剂，称之为核酶(ribozyme)。核酶的发现打破了多年来“酶的化学本质就是蛋白”的传统观念。人们认识到，RNA的生物功能远非传递遗传信息那么简单。,8,RNA领域的新发现：1、RNA控制着蛋白质的生物合成；2、RNA具运动功能；3、RNA具调控功能；4、RNA调控遗传信息；5、RNA修饰；6、RNA携带遗传信息；7、RNA与疾病的关系；8、基因组研究中的“垃圾”可能是RNA基因。,9,1RNA控制着蛋白质的生物合成生物体内绝大多数生化反应由酶（蛋白质）催化控制。多少年来，人们努力寻找催化蛋白质生物合成的关键
4、酶（转肽酶）。直到2000年，通过X线衍射分析核糖体大、小亚基的晶体，发现在肽键形成处纳米的范围中，完全没有蛋白质的电子云存在。说明肽健的形成是由RNA催化。核糖体是核酶，这成了2000年的世界第二大科学成就。,10,2RNA具运动功能噬菌体29装配过程中，首先由外壳蛋白组装成噬菌体的外壳，然后由一种称为门RNA（pRNA），在噬菌体基部的门上，装配成分子马达，依赖此分子马达的转动，将噬菌体DNA装入病毒外壳。,11,3RNA具调控功能（1）男性第23对染色体是XY，女性的第23对染色体是XX。如女性两条X染色体都正常表达的话，女生X编码基因的表达量将是男性的两倍。事实是男女性X染色体编码蛋白
5、的表达量是一致的。其原因是女性Xist基因编码不表达蛋白质的RNA，它与条X染色体中的一条结合，使其失活。,12,（2）染色体DNA3末端在端粒酶的作用下，以端粒RNA为模板，合成端粒DNA。细胞分裂时，DNA每复制一次，端粒DNA缩短点，直到端粒全部消失。此时细胞再也不能分裂，走向死亡。成人正常细胞没有或活性低的端粒酶和端粒RNA。癌细胞却含有端粒酶和端粒RNA。所以，也可说是端粒RNA，控制了细胞的寿命和癌症的发生。,13,4RNA调控遗传信息（1）动植物等真核生物的基因有很多是断裂基因。即基因的初始转录物（RNA前体）中，段段的蛋白质编码区被居间序列分开。只有居间序列被去除后，才能成为蛋
6、白生物合成的模板。这过程称为RNA剪接。通过不同方式的RNA剪接，种基因可在不同的发育分化阶段、不同的生理病理条件或不同的细胞、组织中合成不同的蛋白质。果蝇的性别就是通过不同的剪接途径完成的。,14,（2）很多生物RNA的成熟过程中，均需经RNA的编辑。一种RNA编辑是以另一RNA为模板来修饰RNA前体。通过编辑，可以给RNA前体添加新的遗传信息。（3）在蛋白质生物合成过程中，有多种称为再编码的方式。通常，RNA编码区的每三个核苷酸组成一个密码子。此时，编码区的每个核苷酸只能也必须被阅读一次。但在再编码过程中，有的核苷酸被跳过而没被阅读，有的核苷酸却被阅读了两次，有的密码子被用来翻译特殊氨基酸
7、。,15,5RNA修饰RNA由种核苷酸组成，但通过核苷酸的修饰增加了RNA结构的复杂性，为RNA功能多样性提供了物质基础。RNA中核苷酸的甲基化修饰和假脲嘧啶的生物合成、以及其加工和细胞定位转运，均有一类小分子RNA参与。,16,6RNA携带遗传信息在一些病毒中，不是DNA，而是RNA携带遗传信息。严重危害人民健康的HIV病毒（艾滋病）、丙肝病毒（肝癌）等是RNA病毒。,17,7RNA与疾病的关系RNA突变或异常可引起疾病，如红斑狼疮、重症肌无力、某些型糖尿病、某些帕金森病、某些老年性痴呆等。一些RNA突变后，造成蛋白质合成障碍或蛋白质合成错误率的增加。因此，一种RNA突变，常可因其发生的部位
8、（如组织细胞）的不同，影响到不同的蛋白质，而引起不同的疾病。不同RNA的突变又可能因为发生在同一种细胞或组织中，而引起同一种疾病。也可因引起一系列蛋白质合成的错误，而表现为综合征。,18,8基因组研究中的垃圾可能是RNA基因基因组研究过程中，科学家发现大量不编码蛋白质的重复序列。它们一度被称之为“垃圾”。这种“垃圾”越是在高等生物中含量越多。现发现，这些“垃圾”中的一种，称为Alu家族的序列被认为是反式可移动元件。它调控邻近基因的表达。,19,RNA的生物功能远超出了遗传信息传递中介的范围，所以研究所有上述各种RNA的时空表达情况及其生物学意义，将在全面破解生命奥秘过程中发挥重要作用。中外科学
9、家都注意到了以此为研究对象的RNA组问题。我国科学家在1998年12月第109次香山科学会议、2000年1月第11次东方科技论坛和2000年3月国家重点基础研究计划（973项目）评审会上，提到了“功能RNA组研究”。,20,中、美、日、德、法、英六国科学家和美国塞莱拉公司于2001年2月12日联合公布人类基因组图谱及初步分析结果。人类基因组共有3万至3.5万个基因，其中蛋白质合成的有关基因只占整个基因组的2。由此产生疑问：如果一个基因编码一个蛋白质的话，这么少的蛋白质如何维持人体那么复杂而多变的生命现象？如果一个基因可以表达出多种蛋白，生物又是如何做到这一点的？不编码蛋白质的98的基因组有何功
10、能？RNA和RNA组学研究可以部分解答。,21,RNA组学定义：对细胞中全部RNA分子的结构与功能进行系统的研究，从整体水平阐明RNA的生物学意义即为RNA组学(RNomics)的主要任务。,22,转录组即特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，包括mRNA和非编码RNA。小分子RNA是生物体内一类重要的特殊分子，诱导基因沉默，参与细胞生长、发育、基因转录和翻译等诸多生命活动的调控过程。,23,RNA的种类及主要功能,Ribosomal RNAs(rRNAs):translationTransfer RNAs(tRNAs):translation Messenger RNAs(
11、mRNAs):protein templateNoncoding RNAs(ncRNAs):various types and functions,24,Non-coding RNA,1.不翻译成蛋白质，具有重要的调控功能 2.分类：a.transfer RNA(tRNA)b.ribosomal RNA(rRNA)c.snoRNAs,d.microRNAs,e.siRNAsf.piRNAs:与piwi相互作用的RNA g.long ncRNAs:Xist,25,细胞的RNA组成,26,研究热点 RNA干扰技术、RNAi(RNA干扰)研究程序、合成SiRNA(小干扰RNA)及其基础理论和应用研究
12、。,27,tRNA&rRNA,28,rRNA基因和tRNA基因 只转录产生相应的RNA而不翻译成多肽链,29,snoRNAs,snoRNAs:Small nucleolar RNAs;介导其他RNA分子的化学修饰，例如甲基化,30,microRNA/miRNA,是一大家族小分子非编码单链RNA，长度约2025个碱基，由一段具有发夹环结构，长度为7090个碱基的单链RNA 前体(pre-miRNA)经Dicer酶剪切后形成，调控基因的表达。,31,Cullen Nature Immunology 7:563 2006,32,其长度一般为2025个碱基；在不同生物体中普遍存在；其序列在不同生物中具
13、有一定的保守性；具有明显的表达阶段特异性和组织特异性；miRNA 基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中，大多位于基因间隔区。,miRNA的特点：,33,小干扰RNA：是细胞内一类双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)在特定情况下由Dicer（RNAase 家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成。具有特定长度(2123个碱基)和特定序列的小片段RNA。双链siRNA参与RISC组成，与特异的靶mRNA完全互补结合，导致靶mRNA降解，阻断翻译过程。由siRNA介导的基因表达抑制作用被称为RNA干涉(RNA interference，RNAi)。,Si
14、RNA,34,30bp 双链RNA（dsRNA）,水解生成21-23nt siRNA,5,3,3,5,RISC形成,识别特异序列并使其降解,RNA干扰作用机制,35,RNA干扰作用机制,36,siRNA 和miRNA的差异比较,37,miRNA与siRNA作用机制的比较,38,基因组学领域的分类,根据生物系统特征分类,结构基因组学(Structural genomics)功能基因组学(Functional genomics),基因组图谱绘制、测序基因和基因组组织基因组调节网络结构蛋白质结构特征,转录组学(Transcriptomics)蛋白质组学(Proteomics)代谢组学(Metabol
15、omics),39,40,基因组、转录组和蛋白质组,基因组,转录组,蛋白质组,化学生物学,41,编码蛋白质的基因数量,42,基因数量 生物复杂性？,1.基因数量的变化，无法解释生物学功能、调控机理以及物种多样性和复杂性的巨大变化 2.当前解释：蛋白质组的多样性和复杂性 物种的多样性和复杂性；3.两种观点：a.转录后层面，mRNA剪切，产生拼接异构体b.蛋白质层面，蛋白质序列上一个或多个位点上发生的翻译后修饰,43,isoform 1,isoform 2,isoform 3,mRNA Splicing,转录后层面：mRNA Splicing,44,Phosphorylation,Sumoylat
16、ion,Palmitoylation,Acetylation,Ubiquitination,蛋白质层面：翻译后修饰,45,基因组研究最终可提供全套的DNA序列，从中可检出所有的蛋白质基因。由于每个细胞都有全套遗传信息，但不同生长发育阶段、不同组织或不同生理病理情况下的蛋白质谱是不同的。因此，1995年提出蛋白质组学，以研究蛋白质在不同时空情况下的表达及其生物学意义。由于DNA与蛋白质的不完全对应性，1997年又有人提出了转录组学（Transcriptomics），以研究蛋白基因转录的时空关系及其生物学意义。,46,转录组学（Transcriptomics）转录组（transcriptome）：
17、转录组即一个活细胞所能转录出来的所有mRNA，它不仅能揭示基因组序列中哪些序列能够表达，而且还能揭示在何时何处表达，以及转录活跃程度。转录组学（transcriptomics）：就是在基因组学后新兴的一门学科，即研究细胞在某一功能状态下所含mRNA的类型与拷贝数。即研究生物细胞中转录组的发生和变化规律的科学就称为转录组学(transcriptomics)。,47,转录组与基因组的区别,与基因组不同的是，转录组的定义中包含了时间和空间的限定。同一细胞在不同的生长时期及生长环境下，其基因表达情况是不完全相同的。人类基因组包含有30亿个碱基对，其中大约只有2.5万个基因转录成mRNA分子，转录后的m
18、RNA能被翻译生成蛋白质的也只占整个转录组的40%左右。通常，同一种组织表达几乎相同的一套基因以区别于其他组织，如：脑组织或心肌组织等分别只表达全部基因中不同的30%而显示出组织的特异性。,48,转录组谱可以提供什么条件下什么基因表达的信息，并据此推断相应未知基因的功能，揭示特定调节基因的作用机制。通过这种基于基因表达谱的分子标签，不仅可以辨别细胞的表型归属，还可以用于疾病的诊断。例如：阿尔茨海默病(Alzheimers diseases,AD)中，出现神经原纤维缠结的大脑神经细胞基因表达谱就有别于正常神经元，当病理形态学尚未出现纤维缠结时，这种表达谱的差异即可以作为分子标志直接对该病进行诊断
19、。,49,目前对自闭症诊断靠长达十多个小时的临床评估才能做出判断。基础研究证实自闭症不是单一基因引起，可能是由一组不稳定的基因造成的多基因病变，通过比对正常人群和患者的转录组差异，筛选出与疾病相关的具有诊断意义的特异性表达差异，一旦这种特异的差异表达谱被建立，就可以用于自闭症的诊断，更早地，甚至可以在出现自闭症临床表现之前就对疾病进行诊断，并及早开始干预治疗。转录组的研究应用于临床的例子是可以将表面上看似相同的病症分为多个亚型，尤其是对原发性恶性肿瘤，通过转录组差异表达谱的建立，可以详细描绘出患者的生存期以及对药物的反应等等。,50,目前用于转录组数据获得和分析的方法:主要有基于杂交技术的芯片
20、技术包括cDNA芯片和寡聚核苷酸芯片;基于序列分析的基因表达系列分析SAGE（serial analysis of gene expression，SAGE）大规模平行信号测序系统MPSS(massively parallel signature sequencing,MPSS)。,51,1991年Affymetrix公司在Southern blot 基础上，开发出世界上第一块寡核苷酸基因芯片，自此微阵列技术（基因芯片）得到迅速发展和广泛应用，已成为功能基因组研究中最主要的技术手段。但是芯片无法同时大量地分析组织或细胞内基因组表达的状况，而且由于芯片技术需要准备基因探针，所以可能漏掉那些未知的
21、、表达丰度不高的、可能是很重要的调节基因。,52,转录组学的研究方法DNA芯片技术,53,SAGE是近年来发展的以测序为基础的分析特定组织或细胞类型中基因群体表达状态的一项技术。显著特点是快速高效地、接近完整地获得基因组的表达信息。SAGE可以定量分析已知基因及未知基因表达情况，在疾病组织、癌细胞等差异表达谱的研究中，SAGE可以帮助获得完整转录组学图谱、发现新的基因及其功能、作用机制和通路等信息。,54,大规模平行信号测序系统MPSS是对SAGE的改进，它能在短时间内检测细胞或组织内全部基因的表达情况，是功能基因组研究的有效工具。配套的软硬件较为昂贵，目前国内外的相关应用报道不多。MPSS技术对于致病基因的识别、揭示基因在疾病中的作用、分析药物的药效等都非常有价值，该技术的发展将在基因组功能方面及其相关领域研究中发挥巨大的作用。,55,转录组表达谱应用检测基因突变，例如：新剪接突变，基因融合，SNP，或其他特异性的编码突变检测罕见转录本或是新转录本不同物种或不同生物学样本的基因组表达谱分析与比较,
