生物化学技术6凝胶过滤.ppt

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1、第六章 凝 胶 过 滤,凝胶过滤是20C-60Y发展起来的一种分离纯化方法；又称分子筛层析、排阻层析原理：凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被阻挡在外部，从而使混合溶液中各种组分按分子质量不同进行筛分特点：设备简单，操作方便、重复性好、回收率高用途：分离纯化蛋白质、核酸、多糖、激素等，测定蛋白质分子质量、样品的浓缩和脱盐等,目 的,掌握凝胶的分类和性质掌握凝胶过滤的基本原理熟悉凝胶过滤的操作与应用,第一节 凝胶的分类及性质,凝胶是一类不溶于水，但在水中有较大膨胀度和较好分子筛作用的化合物 目前主要有葡聚糖凝胶、天然琼脂糖和交联琼脂糖；其次，还有聚丙烯酰胺凝胶（生物胶）、交

2、联葡聚糖与双丙烯酰胺共聚凝胶，以及交联琼脂糖与葡聚糖共价结合的凝胶等,商品名称：Sephadex，由葡聚糖右旋糖酐(G型)和3-氯-1，2环氧丙烷(交联剂)以醚键交联而成 在交联葡聚糖G-25、G-50中加入羟丙基后，即可构成烷基化（LH型）葡聚糖凝胶,一、葡聚糖凝胶,性状：外观为白色珠状颗粒，在显微镜下可见表面为网状皱纹溶解性：带有大量的羟基，亲水性好，因此在水溶液或电解质溶液中极易膨胀 型号：Sephadex G-n（n越大，则交联度越小，而膨胀度、吸水量和筛孔直径则越大应用：,1.理化性质,凝胶过滤层析：以G型Sephadex为固定相，水为流动相，对水溶性物质进行分离凝胶渗透层析：以LH

3、型Sephadex为固定相，以有机溶剂为流动相，对脂溶性物质进行分离,在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中是稳定的、不溶解的 强酸或氧化剂溶液时，则容易使糖苷键水解断裂 在室温下长期保存时，应加入适量的防腐剂如CHCl3、0.05NaN3或20EtOH等,2.稳定性,含少量的羧基基团，为弱酸性物质。能与带正电荷的分离物如碱性蛋白质等发生吸附克服方法：提高洗脱液的离子强度至0.05以上，可克服此非特异性吸附 常用含有NaCl的缓冲液作洗脱液。新购得葡聚糖凝胶对蛋白质往往有不可逆的吸附性能，虽然吸附的数量较少，但在定量测定或者分离纯化极难得到的物质时，也需先用易得到的蛋白质进行预层析，以

4、便消除其影响,3.吸附性,葡聚糖凝胶对芳香族化合物或杂环化合物以及某些凝集素具有较强的吸附作用，若采用凝胶过滤层析分离它们时，往往利用的是吸附性能，而不是排阻原理,琼脂糖是从琼脂中分离出来的一种由D-半乳糖和3,6脱水的L-半乳糖连接而成的多糖。其商品名因生产厂家不同而异瑞典、中国：Sepharose美国：Bio-gel A 15m，排阻分子量小于15million的分子，即15 106（排阻限度）英国：Segavac，粉状、颗粒状丹麦：Gelarose除Segavac外，都是以珠状琼脂糖凝胶形式出售,二、琼脂糖凝胶,1.性 质,高温时呈液态，经凝集即成琼脂糖凝胶对尿素、盐酸胍等具有较强的抵抗

5、力，在pH4.09.0缓冲液中稳定层析流速较高干胶易脱水破裂，一般存放于含防腐剂的水溶液中，避免剧烈搅拌,Sepharose 2B(2)、4B(4)和6B(6)Sepharose 6B的机械强度大于2B，但是筛孔小于2B Sepharose与1，3-二溴异丙醇(1,3-dibromopropanol)在强碱性条件下反应后，即生成CL型交联琼脂糖(Sepharose CL）这种琼脂糖的筛孔与同浓度的、未交联的琼脂糖相同，但耐热、耐酸碱。但是在氧化剂存在下，会有少量的多糖链发生解聚（稳定性提高）,2.应用形式（按浓度分）,3.特 点,机械强度和筛孔的稳定性都比葡聚糖凝胶好；且层析时流速较快,商品名

6、称：Bio-gel（生物胶）。以甲撑双丙烯酰胺(双体)作交联剂，以过硫酸铵作催化剂，在N，N，N，N-四甲基乙二胺(TEMED)加速剂的作用下（化学催化），将丙烯酰胺(单体)聚合而成 当改变单体浓度时，就可得到吸水率不同的产物。商品聚丙烯酰胺凝胶型号有Bio-gel P-2到P-300，其阿拉伯数字表示排阻限度 如 Bio-gel P-150的排阻限度为小于150 103 Da,三、聚丙烯酰胺凝胶,聚丙烯酰胺凝胶一般制成珠状颗粒，使用前必须溶胀。能忍受浓的盐、尿素和胍盐等溶液的浸泡；耐酸碱，但要避免长期与强酸和强碱接触，如果与其接触并在高温条件下，酰胺基将迅速发生分解 聚丙烯酰胺凝胶对芳香族的

7、、酸性和碱性的化合物稍有吸附现象 克服吸附的方法：提高洗脱液的离子强度,Sephacryl是由烯丙烷基葡聚糖与甲撑双丙烯酰胺共价交联制成。此凝胶属硬性凝胶，它具有一定大小的筛孔和少量的羧基基团耐酸碱、耐去污剂、耐解离剂，甚至可用去污剂、盐酸胍或尿素溶液作洗脱剂 多用于蛋白质、核酸、多糖和蛋白聚糖的分离纯化，也用于病毒颗粒的分离,四、Sephacryl,由高交联度的琼脂糖与葡聚糖共价结合而成特点：具有良好的分子筛特性和理化稳定性。溶液的酸碱度可在pH312范围内变化；溶液中加入去污剂(如1SDS)和(或)解离剂(如8mol/L尿素、6mol/L盐酸胍)时，也不会影响分离效果,五、Superdex

8、,Superose：高交联度的多孔琼脂糖珠玻璃珠：有大量的网孔，且分布均一。机械性能良好，在较高的层析流速下，分辨率并不受影响，其缺点是对蛋白质等物质有吸附能力聚苯乙烯凝胶,五、其 他,第二节 基本原理,一、基本原理,凝胶过滤层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径较一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而小分子化合物则可以在筛孔中自由扩散和渗透。某种组分凝胶层析柱中被排阻的程度用 表示,洗脱体积；外水体积；凝胶床体积,在一定层析条件下，和 均为固定值，而 随着被分离物分子量的变化而变化。组分分子量越大，则洗脱更容易（排阻越多），越小，越小,各组分间的

9、 值差异越大，分离效果越好；差异越小,则分离效果很差，或根本无法分离 流出物用部分收集器等量或等时收集，检测后分段合并相同组分的各管流出物，得到分子量不同的各种组分,1、当Kav=0时，则Ve=Vo，即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质全排阻，洗脱体积等于空隙体积即外水体积（图中组分）2、当Kav=1时，Ve=Vo+Vi。即小分子可完全渗入凝胶内部时，洗脱体积应为空隙体积与内水体积之和。Ve=Vo+Vi（图中组分）,3、当0Kav1时，Ve=Vo+Kav（Vi Vg）。表示固定相中只有一部分可被组分扩散渗入，一部分被排阻，Ve即在Vo与Vo+ViVg之间变化（图中组分）,4、有时Kav1，表

10、示凝胶对组分有吸附作用（从内水中洗脱出来的含量下降），此时VeVo+ViVg。例如一些芳香族化合物如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸等在Sephadex G-25中的洗脱体积远超出理论计算的最大值,二、值的测定,只要测出、和，即可计算出 值,的测定：（1）计算法：（2）测定法：,的测定：用蓝色的葡聚糖2000（M=200万），在Sephadex中被完全排阻，并借助其本身的颜色，采用肉眼或分光光度计检测（210、260或620nm）洗脱体积 的测定：用、N-乙酰酪氨酸或其他小分子物质作为洗脱对象。由于分子量小，且无吸附，故洗脱体积刚好是（=1）当分子大小在凝胶孔径的上、下限之间时，则 介于 和 之间（即

11、=0 1）,第三节 操 作,（一）凝胶的选择 1.型号：凝胶型号不一样，筛分范围亦不相同如：Sephadex G 型多用于分离蛋白质；生物胶和 Sephacryl等多用于分离核酸；要除去蛋白质中的盐类，多用Sephadex G-252.粒度：粒度与交联度无关。与粗颗粒相比，细颗粒凝胶之间空间小，装柱易均匀，分离效果好，但流速慢；而粗颗粒凝胶流速快，宜用小颗粒直径的层析柱,一、凝胶的选择与处理,（二）凝胶用量计算,由于凝胶在处理过程中会有一部分损失，故用此法计算出的凝胶用量需增加1020%,（三）凝胶的处理,将所用的干胶置于510倍量的D.W中，充分浸泡（表6-2溶胀时间），用倾斜法去除表面悬浮

12、的小颗粒，再用0.5mol/LNaOH-0.5mol/LNaCl室温浸泡0.5h，抽滤除去碱液，用D.W洗至中性。再用抽气方法以D.W或平衡液除去凝胶颗粒之间的气泡,1柱子的选择当直径相同时，柱长长者比柱长短者分辨率高柱长相同时，直径大者比小者分辨率高床体积相同时，柱长长者比短的分辨率高一般理想的层析柱直径与长度之比是1：251：100；层析柱外面最好有夹套，能控制温度（柱温箱），以保证结果的重复性 2装柱：常用湿装法（第三章）3凝胶柱的鉴定,二、凝胶柱的制备,流速、柱长对分离的影响,加样量与层析柱床体积及检测方法的灵敏度有关。床体积越小、方法灵敏度越高时，加样量越少 层析的目的在于分析时，加

13、样量占床体积的12，作制备、脱盐用时，占2030 一般来说，加样量越少，分辨率越高。具体加样体积由分配系数(Kav)或洗脱体积(Ve)来决定,三、加样与洗脱,（一）加 样,VeA、VeB：组分A、B的洗脱体积 KavA、KavB：组分A、B的分配系数 Vs：A、B两组分的洗脱体积之差（又称为分离体积）Vs=VeA VeB当样品体积VpVs时，理论上的洗脱图形是两种物质恰好分开(图中)。但由于样品流过柱时的扩散作用，其体积会逐渐增大，致使其洗脱体积远比原来大,加样量（Vp）的确定,图、中A、B两种物质有一定程度的交叉，这表明二者只是部分分开。因此，当Vp等于或大于Vs时，A、B两种物质就不能完全

14、分开(图中)当VpVs时，A、B两种物质就能分开(图中)根据 Ve=Vo+Kav（Vt Vo）又 Vs=VeAVeB=（KavAKavB）（Vt Vo）,Vs=（KavAKavB）（Vt Vo）=（KavAKavB）（Vi+Vg）A、B两种物质能分开的最低限：VpVs最大Vs时的必要条件：KavAKavB 最大，为101 Vi+Vg最大，一般为Vt/2则：最大理论加样量VpVsVt/2,最大理论加样量的计算,为提高分离效果，除了缩小加样体积以外，样品的黏度也一般以小于2cp(厘帕，P=N/m2s)，或者与洗脱液的黏度相当为宜 葡聚糖使粘度上升,黏度的影响,粘度对柱层析的影响,1.洗脱液的选择原

15、则 能溶解被洗脱物质而又不使其变性或失活 一般以单一缓冲液（如PBS、Tris-HCl缓冲液等）或盐溶液，有时甚至用D.W作为洗脱液 2.洗脱速度 若流速不均匀，收集的每一部分洗脱体积不恒定，Kav就难以确定 最好的装置是恒流泵(微量泵、蠕动泵)，可以使流速在较大范围内恒定。若无此装置，可用控制操作压的办法进行，其装置可使用恒压瓶 一般，洗脱速度慢，分离效果就好；但若太慢，由会因扩散加剧而影响分离效果,(二)洗 脱,。,Sephadex G-50及其以下（交联度大）的流速与操作压之间的关系遵守Darcys规律,u：线性流速(ml/cm2h)K：常数(粗、中、细颗粒的各不相同)P：操作压(cp)

16、L：柱长,流速与操作压,Ko仅与凝胶的性质有关，而与柱子直径基本无关。但是G-75以上各种型号交联葡聚糖的流速还与柱直径大小有关,当洗脱液的黏度为lcp时的表达式,一般，洗脱流速慢，则分离效果就好；但太慢又会因扩散加剧而影响分离效果,四、凝胶柱的再生及保存,（一）再生 使用过一次或几次的凝胶柱，通常用34倍床体积的洗脱液冲洗，再用平衡液平衡即可；但使用过多次后，凝胶床体积变小、流动速度下降、杂质过多等，其处理方法是 先用水反复进行逆向冲洗（反冲），再用缓冲液进行平衡；把凝胶倒出，用低浓度的酸或碱按其预处理方法进行处理，然后重新装柱,膨胀状态 即在水相中保存。可加入0.02%的叠氮钠（NaN3）

17、溶液等防腐剂或加热灭菌后于低温短时间保存。一般不用氯仿、丁醇、甲苯等为防腐剂。因为它们能引起凝胶颗粒的收缩，同时还能进入层析仪器的塑料部件，使塑料变软，造成不良后果,（二）保 存,半收缩状态：用完后水洗净，然后再用60%70%乙醇洗，则凝胶体积缩小，于低温较长时间保存干燥状态：用水洗净后，加入含乙醇的水洗，并逐渐加大含醇量，最后用95%乙醇洗，则凝胶脱水收缩，再用乙醚洗去乙醇，抽滤至干，于6080烘干后长时间保存不脱水而直接烘干会黏结成块,第四节 应 用,原理：盐类小分子物质进入凝胶筛孔，而大分子物质则被排阻在外（分子筛原理）优点：与透析相比，速度快，不会引起大分子物质变性材料：细颗粒葡聚糖凝

18、胶G-25,一、脱盐和浓缩,分离对象：溶解度、带电性等理化性质相似而分子质量不 同，或者是聚合度不等的混合物溶液实例：Sephadex G-200层析纯化AFP 制备Ag-Ab复合物 溶于少量0.1mol/L Gly-HCl缓冲液中，并用本液透析2h 上Sephadex G-200柱 得AFP峰 置0.1mol/L柠檬酸-磷酸缓冲液（pH4.8）透析 上柱洗脱 AFP纯品,二、分离生命物质,热源物质：指微生物产生的分子量很大的某些多糖蛋白复 合物等，能使人体发热的物质材料：Sephadex G-25（80120目）特点：比活性炭吸附、离子交换吸附等方便 实例：用Sephadex G-25凝胶层

19、析除去氨基酸粗品中的热源质：利用热源（大分子蛋白类）的Kav=0，而氨基酸的Kav1，将试剂量控制在柱体积的2030%，能实现完全分离,三、去热源物质,原理：Kav=b lgM+c 或lgM=adKav(M为分子质量，常数a、b、c、d均大于0)先做标准曲线，再在相同条件下测样品Kav 也可用以下4个指标代替VeVo：分离体积Ve/Vo：相对保留体积（另R Vo/Ve）Ve/Vt：简化的洗脱体积，受柱的填充情况的影响较小 Ve：洗脱体积特点：简便实用，所需样品量较少,四、测定分子质量,pH68的范围内，曲线线性才比较好；而在极端pH时，由于变性等原因易偏高 一般适用于球状pro的分子量测定，而

20、纤维状pro不合适糖蛋白中若糖的比例5时，测定结果偏大不受变性剂如尿素和盐酸胍的影响有些酶类不适用。如淀粉酶，能与葡聚糖凝胶形成络合物，这种络合物与酶-底物络合物相似，因此在凝胶层析时有异常反应,用凝胶过滤法测定分子量的局限性,若在Sephadex分子上连接DEAE、羧甲基或磺酸乙基等离子基团，可使凝胶在具有分子筛基础上，还具有离子交换能力，大大提高Sephadex在生化制药中的应用范围 如：DEAE-Sephadex A-25可用于制备无热原物质的去离子水,五、其 他,4在凝胶层析柱中分离某有效成分时，洗脱体积为140ml，其外水体积和总体积分别为60ml和200ml，求分配系数是多少?,思考题,解：Ve=Vo+Kav（Vt Vo）140=60+Kav（200 60）Kav=0.57,解：最大理论加样量 Vp=Vs=Vt/2=3.14(5.0/2)2 60/2=589ml,思考题,5在5.0cm60cm的凝胶柱中脱盐时，就理论值而言，最 多加样体积是多少毫升?,