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1、第一章 蛋白质化学 周口师范学院生命科学系(2008.09),主要内容,一.蛋白质及其生物学意义,二.蛋白质的组成与分类,三.蛋白质的基本单位-氨基酸,四.肽,五.蛋白质的结构,六.蛋白质分子结构与功能的关系,七.蛋白质的性质分析,蛋白质(protein,1838年提出,最重要的/最原始的/最根本的)(是由许多不同的-氨基酸按一定的序列通过酰胺键（肽键）缩合而成的，具有复杂结构和重要生物学功能的高分子有机物质，是生命体系中最重要的成分.典型的蛋白质分子含数百至数千个Aa残基，分子量数千至数百万。,一.蛋白质及其生物学意义,蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。蛋
2、白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。,一.蛋白质及其生物学意义,1.作为生物催化剂：在体内催化各种物质代谢反应的酶几乎都是蛋白质。2.调节代谢反应：一些激素是蛋白质或肽，如胰岛素、生长素。3.运输载体：如红细胞中运输O2、CO2要靠Hb(Hemoglobin血红蛋白)、运输脂类物质的是载脂蛋白、运铁蛋白等转运蛋白或叫载体蛋白。4.参与机体的运动：如心跳、胃肠蠕动等，依靠与肌肉收缩有关的蛋白质来实现，如肌球蛋白、肌动蛋白。5.参与机体的防御：机体抵抗外来侵害的防御机能，靠抗体，抗体也称免疫球蛋白，是蛋白质。6.接受传递信息：如口腔中的味觉蛋白、视网膜中的视觉蛋白。7.调节或
3、控制细胞的生长、分化、遗传信息的表达。8.其它：如鸡蛋清蛋白、牛奶中的酪蛋白是营养和储存蛋白；胶原蛋白、纤维蛋白等属于结构蛋白。还有甜味蛋白、毒素蛋白等都具有特异的生物学功能。,一.蛋白质及其生物学意义,C、H、O、N，大多含有 S.有的还含有P、Fe、I、Cu、Mo、Zn（碳 50-55%、氢、氧 19-24、氮 16%、硫 0-3、）其他 微 量,1.元素组成,各元素的百分比对于大多数蛋白质都较相似，其中 N约占16%。这可用于测定蛋白质的含量凯氏定氮法。蛋白含量含氮量/16含氮量X6.25,二.蛋白质的组成与分类,2.蛋白质的氨基酸组成,蛋白质的基本结构单元是氨基酸(amino acid
4、)多个氨基酸首尾连结形成长而不分支的多聚物多肽链多肽链再折叠卷曲，形成蛋白质,3.蛋白质的分类,a-氨基酸,C,三.蛋白质的基本单位-氨基酸(amino acid),组成蛋白质的氨基酸都为L型（除Gly外）,D型 与 L型,1.氨基酸的构型与分类,1.1 氨基酸的构型,1.2 蛋白质中常见氨基酸的结构,甘氨酸 Glycine,脂肪族氨基酸,氨基乙酸,氨基酸的结构,脂肪族氨基酸,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine,-氨基丙酸,氨基酸的结构,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine缬氨酸 Valine,脂肪族氨基酸,-氨基异戊酸,氨基酸的结构,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Al
5、anine缬氨酸 Valine亮氨酸 Leucine,脂肪族氨基酸,-氨基异己酸,氨基酸的结构,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine缬氨酸 Valine亮氨酸 Leucine异亮氨酸 Ileucine,脂肪族氨基酸,-氨基-甲基戊酸,氨基酸的结构,甘氨酸Glycine 丙氨酸Alanine缬氨酸Valine亮氨酸Leucine异亮氨酸 Ileucine脯氨酸 Proline,亚氨基酸,-吡咯烷基-羧酸,氨基酸的结构,甘氨酸Glycine 丙氨酸Alanine缬氨酸Valine亮氨酸Leucine异亮氨酸 Ileucine脯氨酸Proline甲硫氨酸 Methionine,含硫氨基酸,
6、-氨基-甲硫基丁酸,氨基酸的结构,甘氨酸Glycine 丙氨酸Alanine缬氨酸Valine亮氨酸Leucine异亮氨酸Ileucine脯氨酸Proline甲硫氨酸 Methionine半胱氨酸 Cysteine,含硫氨基酸,-氨基-巯基丙酸,氨基酸的结构,芳香族氨基酸,苯丙氨酸Phenylalanine,-氨基-苯基丙酸,氨基酸的结构,芳香族氨基酸,苯丙氨酸Phenylalanine酪氨酸Tyrosine,-氨基-对羟苯基丙酸,氨基酸的结构,芳香族氨基酸,苯丙氨酸Phenylalanine酪氨酸Tyrosine色氨酸 TryptophanTrp,-氨基-吲哚基丙酸,氨基酸的结构,碱性氨基酸
7、,精氨酸 Arginine,-氨基-胍基戊酸,氨基酸的结构,碱性氨基酸,精氨酸 Arginine赖氨酸 Lysine,，-二氨基己酸,氨基酸的结构,碱性氨基酸,精氨酸 Arginine赖氨酸 Lysine组氨酸 Histidine,-氨基-咪唑基丙酸,氨基酸的结构,天冬氨酸 Aspartate,酸性氨基酸,-氨基丁二酸,氨基酸的结构,天冬氨酸 Aspartate 谷氨酸 Glutamate,酸性氨基酸,-氨基戊二酸,氨基酸的结构,丝氨酸 Serine,含羟基氨基酸,-氨基-羟基丙酸,氨基酸的结构,丝氨酸 Serine 苏氨酸 Threonine,含羟基氨基酸,-氨基-羟基丁酸,氨基酸的结构,天
8、冬酰胺 Asparagine,含酰胺氨基酸,氨基酸的结构,天冬酰胺 Asparagine谷酰胺 Glutamine,含酰胺氨基酸,1.3 氨基酸的分类,（一）根据来源分：内源氨基酸和外源氨基酸（二）根据分子组成：脂肪族、芳香族、杂环氨基酸等（三）根据R的极性分：极性和非极性氨基酸根据（四）从营养学角度分：必需氨基酸和非必需氨 基酸（五）是否组成蛋白质来分：蛋白质中常见 氨基酸、蛋白质中稀有氨基酸和非蛋白氨基酸,根据R的化学结构（1）脂肪族氨基酸：1）疏水性：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys；2）极性：Arg、Lys、Asp、Glu、Asn、Gln、Ser、Thr（2）芳香
9、族氨基酸：Phe、Tyr（3）杂环氨基酸：Trp、His（4）杂环亚氨基酸：Pro,根据R的极性（1）极性氨基酸：1）不带电：Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys；2）带正电：His、Lys、Arg；3）带负电：Asp、Glu（2）非极性氨基酸：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Pro、Trp,人类自身能合成,人类自身不能合成或不能足量合成，必须依赖食物供给。,Ile Leu Lys Met Phe Thr Trp Val Arg His,Ala Asn Asp Cys Glu Gln Gly Pro Ser Tyr,Ile Met Val Leu Trp Ph
10、e Thr Lys 一 家 写 两 三 本 书 来,根据营养功能的不同,在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为不常见蛋白质氨基酸。这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的。,蛋白质中的稀有氨基酸,广泛存在于各种细胞和组织中，呈游离或结合态，但并不存在蛋白质中的一类氨基酸，大部分也是蛋白质氨基酸的衍生物。H2N-CH2-CH2-COOH H2N-CH2-CH2-CH2-COOH,(-丙氨酸),(-氨基丁酸),非蛋白质氨基酸,a.作为细菌细胞壁中肽聚糖的组分：D-Glu D-Alab.作为一些重要代谢物的前体或中间体:-丙氨酸（VB3）、鸟氨酸（Orn）、胍氨酸（Cit）(尿素)c.作
11、为神经传导的化学物质：-氨基丁酸d.有些氨基酸只作为一种N素的转运和贮藏载体（刀豆氨酸）e.调节生长作用f.杀虫防御作用 绝大部分非蛋白氨基酸的功能不清楚。,非蛋白质氨基酸存在的意义,氨基酸同时含有氨基和羧基：氨基具有碱性（质子受体），羧基具有酸性（质子供体）,2.1 氨基酸的两性和等电点,2.氨基酸的理化性质,氨基酸的两性性质,NH3+-C-H,-,COO-,R,NH2-C-H,-,-,COOH,R,两性解离,两性离子：同一分子上带有正、负两种电荷Aa在水溶液或晶体状态下都以两性离子形式存在,-,氨基酸的解离曲线,以中性氨基酸为例，当溶液的pH由低到高时：,滴定曲线,等电点(isoelect
12、ric point),使氨基酸净电荷为零时溶液的pH值，用 pI 表示,此时，COOH及NH2解离度相等。正离子负离子，净电荷为零，在电场中既不向阳极 也不向阴极移动。,pI 是氨基酸的特征性常数,等电点(isoelectric point),20种氨基酸的pI,等电点的计算(以 Gly为例),pI=1/2(pK1+pK2)=1/2(2.34+9.60),pI=1/2(pK2+pK3),溶液 pH 值增大,等电点的计算(以 Lys为例),等电点的计算(以 GLu的解离为例),除Gly（R=H）之外，其余蛋白质氨基酸都有手性（不对称）碳原子，都具有旋光性。,旋光性质,2.2 氨基酸的光学性质,T
13、rp、Tyr、Phe 含芳香环共轭双键系统，最大吸收峰分别在 279nm、278nm、259nm。,紫外吸收,利用紫外分光光度法可快速、简便地测定蛋白质含量。,茚三酮反应,2.3 氨基酸的化学反应,在酸性条件下，氨基酸与茚三酮共热，生成紫色化合物(Pro呈黄色),茚三酮反应,茚三酮反应常用于aa的定性和定量分析,Sanger 反应,在弱碱溶液中，氨基酸的-氨基与2,4-二硝基氟苯(DNFB)反应，生成黄色的二硝基苯氨基酸（DNP-Aa）。,此反应最初被Sanger 用于测定肽链 N-末端氨基酸,Edman反应,可用层析法鉴定出aa的种类,与亚硝酸反应 放出氮气，氮气的一半来自氨基氮，一半来自亚
14、硝酸，在通常情况下测定生成的氮气的体积量可计算氨基酸的量，此反应可用于测定蛋白质的水解程度。,四、肽（peptide）,一个氨基酸的-羧基和另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而成的化合物。氨基酸之间脱水后形成的键称肽键（酰胺键）。,当两个氨基酸通过肽键相互连接形成二肽，在一端仍然有游离的氨基和另一端有游离的羧基，每一端连接更多的氨基酸。氨基酸能以肽键相互连接形成长的、不带支链的寡肽（25个氨基酸残基以下）和多肽（多于25个氨基酸残基）。多肽仍然有游离的-氨基和-羧基。,肽与肽键,一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。,由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由
15、多个氨基酸组成的肽则称为多肽。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。,肽平面,肽链写法,游离-氨基在左，游离-羧基在右，氨基酸之间用“-”表示肽键。H2N-丝氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-COOH,Ser-Leu-Phe,（S-L-F）,肽的重要理化性质,a.肽晶体的熔点都很高。b.肽的酸碱性质主要来自游离末端-NH2和游离末端-COOH以及侧链上可解离的基团。c.每一种肽都有其相应的等电点.d.肽也能发生茚三酮反应、Sanger反应、DNS反应和Edman反应；还可发生双缩脲反应。,在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊
16、的生理功能，常称为活性肽（active peptide）。如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。,几种重要的多肽,L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val L-Orn L-Orn L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu 短杆菌肽S(环十肽)由细菌分泌的多肽，有时也都含有D-氨基酸和一些非蛋白氨基酸。如鸟氨酸（Ornithine,缩写为 Orn）。,五、蛋白质的结构,蛋白质是氨基酸以肽键相互连接的线性序列。在蛋白质中，多肽链折叠形成特殊的形状（构象）（conformation）。在结构中，这种构象是原子的三维排列，由氨基酸序列决定。蛋白质有四种结构层次：一级结
17、构（primary）二级结构（secondary）三级结构（tertiary）四级结构（quaternary）,Primary secondary tertiary quaternary,1.蛋白质的一级结构（化学结构）,一级结构就是蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序，即氨基酸的线性序列。在基因编码的蛋白质中，这种序列是由mRNA中的核苷酸序列决定的。一级结构中包含的共价键（covalent bonds）主要指肽键（peptide bond）和二硫键（disulfide bond）,定义 1969年，国际纯化学与应用化学委员会（IUPAC）规定：蛋白质的一级结构指蛋白质多肽连中AA的排列顺序，包
18、括二硫键的位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。,胰岛素的一级结构,2 蛋白质的二级结构,二级结构的概念：多肽链在一级结构的基础上，按照一定的方式有规律的旋转或折叠形成的空间构象。其实质是多肽链在空间的排列方式。-螺旋、-折叠、-转角、自由回转,-螺旋（-helix）,-螺旋在许多蛋白中存在，如-角蛋白、血红蛋白、肌红蛋白等，主要由-螺旋结构组成。,每3.6个氨基酸残基上升一圈，相当于0.54nm。多个肽键平面通过-碳原子旋转，主链绕一条固定轴形成右手螺旋。相邻两圈螺旋之间借肽键中CO和N-H形成许多链内氢健，即每一个氨基酸残基中的NH和前面相隔三个残基的CO之间形
19、成氢键，这是稳定-螺旋的主要键。肽链中氨基酸侧链R，分布在螺旋外侧，其形状、大小及电荷影响-螺旋的形成。,-螺旋的结构要点,酸性或碱性氨基酸集中的区域，由于同电荷相斥，不利于-螺旋形成；较大的R(如苯丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸)集中的区域，也妨碍螺旋形成；脯氨酸因其-碳原子位于五元环上，不易扭转，加之它是亚氨基酸，不易形成氢键，故不易形成上述-螺旋；甘氨酸的R基为H，空间占位很小，也会影响该处螺旋的稳定。,影响-螺旋稳定的因素,-折叠结构（-pleated sheet）,是一种肽链相当伸展的结构。肽链（段）按层排列，依靠相邻肽链（段）上的羰基和氨基形成的氢键维持结构的稳定性。肽键的平面性使多肽折
20、叠成片，氨基酸侧链伸展在折叠片的上面和下面。,多肽链呈锯齿状（或扇面状、片层状）排列成比较伸展的结构；相邻两个氨基酸残基的轴心距离为0.35nm，侧链R基团交替地分布在片层平面的上下方，片层间有氢键相连；有平行式和反平行式两种，平行式的折叠其=-119。，=+113。反平行折叠其=-139。，=+135。这种片层在丝心蛋白里大量存在。,-折叠结构结要点,-转角（-turn）又称-弯曲，-回折或发夹结构。指蛋白质的多肽链在形成空间构象时经常会出现180。的回折，回折处的结构就称为-转角。一般由四个连续的氨基酸组成，第一个氨基酸的羧基与第四个氨基酸的氨基形成氢键。也有一些是由第一个氨基酸的羧基与第
21、三个氨基酸的氨基形成氢键。,-转角,为了紧紧折叠成紧密的球蛋白，多肽链常常反转方向，成发夹形状。一个氨基酸的羰基氧以氢键结合到相距的第四个氨基酸的氨基氢上。,-转角经常出现在连接反平行-折叠片的端头。,自由回转（无规则卷曲）,没有一定规律的松散肽链结构。酶的活性部位。,超二级结构是指若干相邻的二级结构中的构象单元彼此相互作用，形成有规则的，在空间上能辨认的二级结构组合体。是蛋白质二级结构至三级结构层次的一种过渡态构象层次。,结构域是球状蛋白质的折叠单位。多肽链在超二级结构的基础上进一步绕曲折叠成紧密的近似球形的结构，具有部分生物功能。对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个以上结构域缔合成
22、三级结构。,折叠筒,结构域（structural domain）,在一些相对较大的蛋白质分子中，在空间折叠时往往先分别折叠成几个相对独立的区域，再组装成更复杂的球状结构，这种在二级或超二级结构基础上形成的特定区域称为结构域。它的结构层次介于超二级结构和三级结构之间。如图所示：,一条多肽链中所有原子在三维空间的整体排布，称为三级结构，是包括主、侧链在内的空间排列。大多数蛋白质的三级结构为球状或近似球状。在三级结构中，大多数的亲水的R侧基分布于球形结构的表面，而疏水的R侧基分布于球形结构的内部，形成疏水的核心。,3.蛋白质的三级结构,三级结构特征,纤维状蛋白质通常只含有一种二级结构，而球状蛋白质往
23、往含有多种二级结构；球状蛋白质具有明显的折叠层次：一级结构二级结构超二级结构、结构域三级结构或亚基四级结构；球状蛋白质是紧密的球状或椭球状实体；疏水性侧链埋藏于球体分子内，亲水性侧链则暴露于表面；球状分子的表面有一个空穴（裂沟、凹槽或口袋），能结合配体，是蛋白质的活性部位；由二级结构向三级结构转变的主要力量是疏水作用。,4 蛋白质的四级结构,二个或二个以上具有独立的三级结构的多肽链(亚基)，彼此借次级键相连，形成一定的空间结构，称为四级结构。具有独立三级结构的多肽链单位，称为亚基或亚单位(subunit)，亚基可以相同，亦可以不同。四级结构的实质是亚基在空间排列的方式.单独亚基，无生物学功能，
24、当亚基聚合成为具有完整四级结构的蛋白质后，才有功能。,5 蛋白质分子中的共价键与次级键,其中二硫键和疏水作用最主要,维持三级结构的作用力,氢键 氢键(hydrogen bond)的形成常见于连接在一电负性很强的原子上的氢原子，与另一电负性很强的原子之间。氢键在维系蛋白质的空间结构稳定上起着重要的作用。氢键的键能较低(12kJ/mol)，因而易被破坏。,氢键的形成:,疏水键,非极性物质在含水的极性环境中存在时，会产生一种相互聚集的力，这种力称为疏水键或疏水作用力。蛋白质分子中的许多氨基酸残基侧链也是非极性的，这些非极性的基团在水中也可相互聚集，形成疏水键，如Leu，Ile，Val，Phe，Ala
25、等的侧链基团。,范德华氏（van der Waals)引力,分子之间存在的相互作用力,离子键（盐键）,离子键(salt bond)是由带正电荷基团与带负电荷基团之间相互吸引而形成的化学键。在近中性环境中，蛋白质分子中的酸性氨基酸残基侧链电离后带负电荷，而碱性氨基酸残基侧链电离后带正电荷，二者之间可形成离子键。,离子键的形成,六、蛋白质分子结构与功能的关系,蛋白质分子具有多样的生物学功能，需要一定的化学结构，还需要一定的空间构象。,各种蛋白质都有特定的空间构象，而特定的空间构象又与它们特定的生物学功能相适应，蛋白质的结构与功能是高度统一的。,一级结构是空间构象的基础,RNase是由124氨基酸残
26、基组成的单肽链，分子中 8 个Cys的-SH构成4个二硫键，形成具有一定空间构象的蛋白质分子。在蛋白质变性剂（如8mol/L的尿素）和一些还原剂（如巯基乙醇）存在下，酶分子中的二硫键全部被还原，酶的空间结构破坏，肽链完全伸展，酶的催化活性完全丧失。当用透析的方法除去变性剂和巯基乙醇后，发现酶大部分活性恢复，所有的二硫键准确无误地恢复原来状态。若用其他的方法改变分子中二硫键的配对方式，酶完全丧失活性。这个实验表明，蛋白质的一级结构决定它的空间结构，而特定的空间结构是蛋白质具有生物活性的保证。,2.前体与活性蛋白质一级结构的关系,由108个氨基酸残基构成的前胰岛素原(pre-proinsulin）
27、，在合成的时候完全没有活性，当切去N-端的24个氨基酸信号肽，形成84个氨基酸的胰岛素原（proinsulin），胰岛素原也没活性，在包装分泌时，A、B链之间的33个氨基酸残基被切除，才形成具有活性的胰岛素(胰蛋白酶原的激活)。,3 蛋白质的一级结构与分子病,现知几乎所有遗传病都与蛋白质分子结构改变有关，都称之为分子病。例如镰刀型贫血症，它是由于血红蛋白的-亚基上的第六位氨基酸由谷氨酸变成了缬氨酸，导致血红蛋白的结构和功能的改变，其运输氧气的能力大大地降低，并且红细胞呈镰刀状。,镰状细胞贫血（sick-cell anemia）从患者红细胞中鉴定出特异的镰刀型或月牙型细胞。,-链 1 2 3 4
28、 5 6 7Hb-A N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-LysHb-S N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys,4 蛋白质空间结构与功能的关系,Hb由4条肽链组成：2、2，功能是运载O2。在去氧Hb亚基中有下列几对离子键：,由于血红蛋白亚基之间存在大量离子键，使其构象呈紧张态，对氧的亲和力很低，第一个亚基与O2结合时，离子键的破坏较难，所需要的能量较多。当血红蛋白的一个亚基结合氧之后引起它的构象从紧张态变成松弛态，其它的离子键也依次破坏，此时破坏离子键所需要的能量也少，构象的变化导致血红蛋白对氧的亲和力大大增强，因此第四个亚基结合氧的能力比第一个大几百倍。
29、,1 蛋白质的两性电离及等电点,蛋白质是两性电解质 在蛋白质分子中，由许多可解离的基团，如末端的氨基、羧基及侧链的咪唑基、胍基、巯基及羟基，也能向酸碱一样解离，因此，蛋白质是多价的两性电解质。蛋白质在其等电点偏酸溶液中带正电荷，在偏碱溶液中带负电荷，在等电点pH时为两性离子。等电点的定义 当溶液在某一特定的pH时，蛋白质以两性离子的形式存在，正负电荷相等，净电荷为零，在电场中不向任何一方移动。此时，溶液的pH称为该蛋白质的等电点。,七、蛋白质的性质,等电点的性质：pI与分子中的酸碱性氨基酸的比例有关。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，其它性质如粘度、渗透压及膨胀性等也都是最小。电泳：带电颗粒在电
30、场中移动的现象。分子大小不同的蛋白质所带净电荷密度不同，迁移率即异，在电泳时可以分开。影响泳动速度的因素：A、电荷多少 B、分子大小 C、电场强度,2 蛋白质的胶体性质,由于蛋白质的分子量很大（1-100nm），它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。透析法：以半透膜提纯蛋白质的方法叫透析法半透膜：只允许溶剂小分子通过，而溶质大分子不能通过，如羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等,布郎运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜，具有吸附能力,蛋白质溶液稳定的原因表面形成水膜（水化
31、层）；带相同电荷。,胶体性质,3 蛋白质的沉淀反应,定义：蛋白质在溶液中靠水膜和电荷保持其稳定性，水膜和电荷一旦除去，蛋白质溶液的稳定性就被破坏，蛋白质就会从溶液中沉淀下来，此现象即为蛋白质的沉淀作用。,沉淀试剂:加高浓度盐类（盐析）：加盐使蛋白质沉淀析出。分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。血清球蛋白（50%(NH4)2SO4饱和度），清蛋白（饱和(NH4)2SO4)。加重金属盐加生物碱试剂(单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸能沉淀生物碱，称生物碱试剂),4 蛋白质的变性,定义:天然蛋白质受物理或化学因素的影响，其共价键不变，但分子内部原有的高度规律性的空间排列
32、发生变化，致使其原有性质发生部分或全部丧失，称为蛋白质的变性(denaturation)。实质:次级键断裂，空间结构破坏。,(变性蛋白质分子互相凝集为固体的现象称凝固),蛋白质的变性,蛋白质变性后的表现 生物活性丧失；溶解度降低，对于球状蛋白粘度增加；生化反应易进行；光吸收系数增大；组分和分子量不变。,物理因素：高温、高压、震荡、紫外线、电离辐射、超声波等。化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐等。,引起蛋白质变性的主要因素,蛋白质的复性,定义：当变性因素除去后，变性蛋白质又可恢复到天然构象，这一现象称为蛋白质的复性（renaturation）。蛋白质变性的利用：医疗方面；食品方面；蛋白质制
33、备；酶制剂保存等。(有些蛋白质的变性作用是可逆的，其变性如不超过一定限度，经适当处理后，可重新变为天然蛋白质),5 蛋白质的颜色反应,OH,N,6 蛋白质的紫外吸收,大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定和定量测定。,7 蛋白质的分离和纯化主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括蛋白质分子的酸碱性质、分子的大小和形状、溶解度、吸附性质和对配体分子的特异亲合力等。,蛋白质纯化的目标:增加制品的纯度，即设法除去变性的和不需要的蛋白质以增加单位蛋白质重量
34、中所需蛋白质的含量或生物活性。分离纯化蛋白质的程序为：前处理（细胞或组织处理）、粗分级分离（除去杂蛋白）和细分级分离。,分子大小,透析和超过滤：透析指利用蛋白质分子不能通过半透膜而与小分子分离；超滤是利用压力或离心力使小分子溶质通过半透膜而蛋白质被截留在膜上而分离。,密度梯度离心：蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，且每种蛋白质颗粒沉降到与其自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成不同的区带。,凝胶过滤：即分子排阻层析。凝胶颗粒内部为多孔的网状结构。大分子最先流出层析柱。,等电点沉淀和pH控制,盐溶和盐析：中
35、性盐在低浓度时可增加蛋白质的溶解度，即盐溶。原因是蛋白质分子吸附盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而与水分子相互作用加强；当离子强度增大到足够高时，此时与蛋白质疏水基团接触的自由水被移去以溶剂化盐离子，导致蛋白质疏水基团暴露，使蛋白质因疏水作用凝聚沉淀。有机溶剂分级分离法：一是降低介质的介电常数，二是与蛋白质争夺水化水。温度沉淀：温度对溶解度有影响，低温稳定，高温不稳定。在040，大部分的球状蛋白质溶解度随温度升高而增加。,溶解度,电荷,电泳（净电荷、分子大小、形状）,区带电泳,聚丙烯酰氨凝胶电泳（PAGE）,毛细管电泳,离子交换层析：是根据蛋白质所带电荷的不同进行分离纯化。常用的阳离子
36、交换剂为羧甲基纤维素（CM-C），阴离子交换剂为二乙氨基乙基纤维素（DEAE-C）。,等电聚焦：外加电场时，蛋白质混合物在具有pH梯度的介质中移向并聚焦（停留）在等于其等电点的pH处，形成区带。,层析聚焦：层析柱中建立连续的pH梯度，蛋白质样品由柱上端随缓冲液的展开而聚焦在各自的等电点pH处，形成区段。,吸附：吸附层析，吸附剂（硅石、氧化铝、活性碳）和疏水吸附剂，与待分离分子和杂质分子的吸附与解吸能力不同。,特异亲和力：亲和层析这是根据蛋白质能与特异的配体相结合而设计的一种方法。,其它：如高效液相层析（HPLC）,快速蛋白液相层析（FPLC）,附A:蛋白质含量测定与纯度鉴定：测定蛋白质含量的常
37、用方法：凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法（Lowry法，标准测定方法）、紫外吸收法、染料（考马斯亮蓝）结合法、胶体金法（带负电的疏水胶体，洋红色，遇蛋白质变蓝色，灵敏度最高）,蛋白质纯度的鉴定方法：采用物理化学方法如电泳、离心沉降、HPLC和溶解度分析等。纯的蛋白质电泳时，其电泳图谱只呈现一个条带或峰，离心时以单一的沉降速度移动；纯的蛋白质在一定的溶剂系统中具有恒定的溶解度，即溶解度曲线只有一个折点，在折点以前直线斜率为1，在折点以后斜率为零；此外，N-末端分析也用于纯度鉴定（单体蛋白质而言）。(必须指出，采用任何单独的一种方法鉴定纯度只能作为蛋白质均一性的必要条件而非充分条件，即蛋
38、白质往往在一种鉴定中表现为均一性，而在另一种鉴定中又表现为不均一性),附表B:测定蛋白质分子相对质量的方法,根据化学组成测定最低相对分子质量：测定某一微量元素或某一氨基酸的含量如铁原子或色氨酸，并假设蛋白质分子中只有一个铁原子或一个色氨酸，即最低相对分子质量=铁的原子量/铁的百分含量,渗透压法：在半透膜存在时，蛋白质溶液将产生渗透压（平衡时的静水压力）。理想溶液的渗透压与溶质的浓度呈线性相关。渗透压法简单、准确、且不受蛋白质分子的形状和水化程度影响，但受pH的影响，不能区别溶液中蛋白质分子是否均一。,沉降法：离心力作用,沉降速率法：单位离心场的沉降速度是个定值，称沉降系数s。,沉降平衡法：沉降产生浓度梯度,凝胶过滤法：标准蛋白质（已知Mr和斯托克半径）和待测蛋白质必须具有相同的分子形状（接近球体），分子形状为线型或与凝胶发生吸附的蛋白质不可用此法测定。,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法：加入SDS和少量巯基乙醇，则电泳迁移率主要取决于其相对分子质量，而与电荷和分子形状无关。,
