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1、第八章 疾病分子遗传学(下),其它疾病的分子遗传学,了解我国科学家在单基因病致病基因克隆、多基因病易感基因寻找中的工作。,1.单基因病：由单个基因缺陷引发。常遵循经典孟德尔遗传定律：一些表现为常染色体显性遗传，如短指、马凡氏征、眼睑下垂征等。有些表现为常染色体隐性遗传，如白化病、先天聋哑等。还有一些致病基因位于性染色体上，呈现性连锁遗传，如红绿色盲。,马凡氏征,白化病,疾病相关基因定位和克隆的常用方法定位克隆候选基因关联分析。以序列标记（突变、微卫星、SNP等）为筛查标记，根据疾病患者组与匹配对照组出现频率的显著性差异，从候选基因中筛出易感基因。这是目前最常用的方法。,疾病相关基因定位和克隆的
2、常用方法 单倍型（haplotype）关联分析 单倍型（haplotype）关联分析。据新近单倍型作图（haplotype mapping）结果表明，人类基因组中含有12万个单倍型域（haplotype block），每个域平均长度为25kb,加起来正好覆盖整个基因组，而每个域最多横跨1个目标基因。因此，可以单倍型域为靶标，进行全基因组扫描，寻找与疾病易感性相关的单倍型域，找到了单倍型域，也就找到了相应的易感基因。,人类基因组单体型图（Haplotype map,以下简称HapMap）计划是人类基因组研究领域的第二个重大战略目标。其主要内容是对亚、非、欧裔全基因组中DNA序列上的多态位点进行测
3、定和分析，由此构建出整合了人类遗传多态信息的每条染色体的“单体型图”。,单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，简称SNP）是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异而引起的DNA序列多态性,频率大于1%。SNPs在人类基因组中广泛存在,并通常以二等位基因的形式出现,便于进行大规模和高通量分析,因此是继限制性酶切长度多态性(RFLP)和微卫星之后的第三代遗传标记。,不同人的遗传序列极为相似。若比较两个人的染色体，他们的DNA序列上可以连续数百个核甘酸都是相同的。然而，平均约每1200个碱基就会有一个核甘酸的不同（图1）。在一个位点上某人是A，另一个人却有可能是G
4、；或者某人在特定的位点上多出或者缺失一些碱基或DNA片段。染色体上每一个不同的“拼写”被称作一个等位位点（allele），一个人染色体上的所有等位位点的集合就是基因型。,图1：当比较两个随机个体的7号染色体上的一段DNA序列时，在2200个核甘酸中出现两个单核甘酸多态位点（SNPs）。,对遗传学家来说，SNPs也是进行基因定位的分子标记。比如说基因上一个拼写的改变会增加罹患高血压的风险，但是研究者们并不知道这个基因在染色体上的位置。他们可以比较高血压患者和正常人的SNPs。如果某一个SNP在高血压患者中很常见，就可以把这个SNP作为标记来定位和识别与这一疾病相关的基因。,SNP最大程度地代表了
5、不同个体之间的遗传差异，因而成为研究复杂疾病、药物敏感性及人类进化的重要标记。至今在人类基因组中已有五百多万个SNP位点被确定。如果每一个对群体或个体的研究项目都要对所有样品中即使是基因组中的一部分序列的每一个SNP位点进行检测、鉴定，其费用将是极为惊人的昂贵。由此，在人类基因组计划协作组基础上建立的“HapMap计划”国际协作组提出了人类基因组研究的第二个战略任务，即再次以多国分担合作的形式，共同构建整合了人类全基因组遗传与变异信息的单体型图。,HapMap的科学基础是染色体上的SNP的“板块”（block）结构。SNPs在一段染色体上是成组遗传的，在DNA上构成无形的区域-“板块”。每个板
6、块在进化上非常保守，在多世代的传递中没有或极少发生DNA重组，其SNPs的构成在单个染色体上的模式，即单体型（Haplotype）。不同个体的DNA序列上的差异因而可以准确的用SNP的始祖板块或单体型表示。,特别是，对于一种单体型来说，只需几个位点作为其标签（tag）SNPs，便可知道整个单体型的模式。因而在检测上只要对几个标签SNPs而无需对所有的位点进行检定，便可确定一个“板块”的单体型。对不同族群SNP单体型的研究还表明，人类基因组中的每一板块或单体型一般只有几种类型。由此绘出揭示人类遗传多态信息的“单体型图”，从全基因组规模大大简化以后的SNP分型研究，为疾病相关的遗传多态研究提供SN
7、P标签位点。,图2：HapMap的构建分为三个步骤：（a）在多个个体的DNA样品中鉴定单核苷酸多态性（SNPs）；（b）将群体中频率大于1%的那些共同遗传的相邻SNPs组合成单体型；（c）在单体型中找出用于识别这些单体型的标签SNPs。通过对图中的三个标签SNPs进行基因分型，研究者可以确定每个个体拥有图示的四个单体型中的哪一个。,在人类染色体的很多区域中，只发现了少数的几种单体型。在一个特定人群中，55的人可能拥有同一种单体型，30的人可能拥有另一种单体型，8的人可能拥有第三种单体型，而其余的人可能拥有若干种稀有的单体型。HapMap计划将鉴定来自世界不同地区的四个群体的常见单体型，以及特异
8、识别这些单体型的标签SNPs。通过检测个体的标签SNPs（该过程称为基因分型），研究者就可以鉴定一个人的单体型的集合。估计包含了大多数遗传变异的模式信息的标签SNPs的数量大约是30万至60万，远远少于一千万个常见SNPs。,一旦从HapMap中获得标签SNPs的信息，研究者将能利用它们来定位与重要医学特征相关的基因。假设研究者想要找到与高血压相关的遗传变异，他并不需要确定一个人的所有SNPs的类型，而只须对少得多的标签SNPs进行基因分型就可以得到一个人的单体型的集合。研究者可以集中研究可能与疾病相关的特定候选基因，也可以纵观整个基因组来找到与疾病相关联的染色体区域。如果高血压患者都倾向于具
9、有一个特别的单体型，与该疾病相关的变异位点很可能就在这个单体型内部或邻近区域。,通过表型与全基因组SNPs图谱的相关研究,理论上可将人类的任何表型、功能、对任何疾病的易感性加以定位,从而对疾病遗传机制的阐明做出重要贡献。然而，即使找到了疾病易感基因和特异性分子表型，也不等于阐明了疾病发生发展的分子作用机理。最终阐明机理尚需进一步搞清楚：该疾病易感基因涉及哪些信号传导通路？这些信号传导通路之间如何发生作用和影响？疾病易感基因在这些信号传导通路内是如何发挥作用及是否与信号传导通路之外的分子发生作用？,多基因病易感基因的确定,全基因组关联分析(Genome-wide association stud
10、ies,GWAS)GWAS 是一种对全基因组范围内的常见遗传变异:单核苷酸多态性(Singlenucleotide polymorph ism,SN P)和拷贝数变异(Copy number variation,CNV)进行总体关联分析的方法,即在全基因组范围内选择遗传变异进行基因分型,比较病例和对照间每个变异频率的差异,计算变异与疾病的关联强度,选出最相关的变异进行验证并最终确认与疾病相关。,GWAS的优势：,在全基因组范围内进行整体研究,能够一次性对疾病进行轮廓性概览,克服了既往的知识和理论造成先入为主的影响,避免了区域研究造成的偏倚和局限。2005 年,科学杂志首次报道了Klein 等利
11、用Affymetrix100K 的基因芯片对年龄相关性视网膜黄斑变性(AgerelatedMacular Degeneration)进行GWAS的结果。此后一系列有关复杂疾病的GWAS报道不断出现,特别是 2006 年后一系列复杂疾病的GWAS 的报道相继刊登在科学、自然、自然遗传和新英格兰医学杂志等世界顶级学术杂志上。,据美国N IH 全基因组关联分析权威数据库收录(http:/www.genome.Gov/26525384)统计显示,目前已有肿瘤、自身免疫病、心血管疾病、神经精神系统疾病、胃肠道疾病及肥胖、身高、肤色、骨密度、血脂等100多种,与人类生命密切相关的重要复杂疾病和/或性状的易
12、感基因被陆续揭示。这些研究成果将会为复杂疾病的机制研究明确方向,为疾病预防、诊断和治疗提供新的契机,为优化个体化诊断、治疗奠定坚实的基础。,GWAS 获选Science杂志2007年科技进展第一名,我国科学家确定银屑病易感基因LCE,银屑病，俗称“牛皮癣”，是一种常见的具有特征性的红斑鳞屑性皮损的易复发的皮肤病；国内发病率约为0.10.3%，估计目前全国约有250300 万银屑病患者。本病无性别差异，各年龄组均可发病（青壮年多见），北方多于南方。,基本病理变化表皮通过时间缩短 从28天 34天；表皮细胞周期缩短 从457小时 37.5小时；表皮角化不全；表皮内的Munro微脓疡；粒层变薄可消失
13、，皮突延长、增宽，乳头部血管扭曲扩张；表皮内和真皮上部淋巴细胞浸润（主要是T细胞）；,正常人的皮肤表皮细胞，其更新一代需28天，而银屑病患者只有3天，临床表现为大量皮肤增厚，鳞屑脱落。让全球2000万患者感到痛苦和难堪，其中有1/5患者在中国。安徽医科大学张学军教授课题组与国家人类基因组南方研究中心、上海生物芯片国家工程中心黄薇研究员课题组，展开了密切的合作。2002年，中国汉族人寻常型银屑病易感基因被定位在染色体4q31上。去年，张、黄课题组联合国内30多家医院，首次在国内开展了中国汉族和维吾尔族人群15000例银屑病大样本的易感基因研究发现一个名为LCE的基因，如果发生变异，会使人更容易患
14、银屑病。LCE基因编码表皮终末分化角质外膜蛋白,发现汉族人红斑狼疮易感基因,系统性红斑狼疮是一种常见的自身免疫性疾病，好发于女性，特别是育龄期妇女，可累及全身各个系统和脏器，最终诱发肾衰竭、狼疮性脑病和严重继发感染，导致患者死亡。该病病情易反复，目前临床上无治愈手段。据估计，目前我国有红斑狼疮患者100多万人。中国科学家通过对12000多名汉族系统性红斑狼疮患者以及健康对照者的研究，发现了5个红斑狼疮易感基因，ETS1、IKZF1、RASGRP3、SLC15A4和TNIP1，并确定了4个新的易感位点 7q11.23,10q11.22,11q23.3 and 16p11.2，同时验证出在欧洲人中
15、发现的7个易感基因在汉族人中同样存在：(BLK,IRF5,STAT4,TNFAIP3,TNFSF4,6q21 and 22q11.21）10月18日，自然遗传（Nature Genetics）在线发表了这一成果。该项研究首次通过遗传学研究证明了红斑狼疮发病机制中的遗传危险因素在不同人种间具有相同和不同的易感基因；同时，该项研究是目前世界上红斑狼疮全基因组关联分析研究中样本量最大的研究项目。,单基因病家系致病基因的克隆复杂疾病人群疾病易感基因与区域的确定,关于GWAS的思考,全基因组关联研究(Genome-wide Association Study,GWAS)是人类基因组计划完成后，实施的一种
16、对复杂性疾病，包括肿瘤、心血管病、糖尿病、肥胖症、精神等疾病的一种成套DNA和全基因组测序和扫描的计划，试图通过测定疾病的基因变异和单核苷酸多态性，建立世界资源共享的相关疾病的基因变异数据库-dbGAP，研究确定疾病发病易感区域和相关基因，寻找疾病的标记物，进行早期诊断和最有效的个体化治疗，开发新药物和新的特异性防治措施。期望在5-10年内鉴定出人类各种重要疾病的主要基因及其变异类型。为此，美国NCI还联合组织了世界上十几个国家，组建了国际癌基因组研究团队(ICGC)，制定了“癌基因组计划”，计划对肺癌、卵巢癌、脑癌等十几种常见肿瘤，25000个样本实施全基因组序列和SNP分析。希望用十几年时
17、间能寻找到致癌元凶，战胜绝症。人们对此寄予无限的期待和希望。,这一计划自2005年实施以来，已经陆续报导和公布了视网膜黄斑、乳腺癌、前列腺癌、白血病、冠心病、肥胖症、糖尿病、精神分裂症、风湿性关节炎等几十种疾病全基因组关联研究的结果。累计发表了近万篇论文(9900篇)。确定了一系列疾病发病的致病基因、相关基因、易感区域和单核苷酸多态性(SNP)的变异，取得了很大成绩。我国在十一五计划中亦对GWAS进行了优先安排，并获得了银屑病全基因组分析的结果。此外，在这一计划的推动下，还发展了一系列高效、快速、价廉的全基因测序和分析的新方法。将世界基因组研究推向一个新阶段。,现在三年已经过去了，其成果并不理
18、想，与人们期望差距甚远。疾病的发病，早期预测，个体化的治疗并非像全基因组的分析那样简单。现在发现这种全基因组分析是高出低收，结果似是而非，有许多分析是无意义和不可靠的，甚至是不科学的。所获得的结果，庞杂无序，大多数的基因变异与疾病并不关联。在已实施的100余项GWAS和几千例患者样本的分析结果发现，许多基因变异都是罕见的基因变异而不是关键基因，有一些变异仅仅与疾病危险因子、诱发因子、影响因子有关，而不是疾病直接相关联的基因。最近NEJM(09.4.15)和Nature(09.5.12)对全基因组关联分析进行了评论，认为全基因组关联研究不能急功近利，更不能过度炒作，夸大其辞，而应该回归理性，实事
19、求是地进行更长远的科学分析和研究。,在疾病的发生中，基因是重要的，但不是唯一的，除了基因以外，还有RNA、蛋白质等；除了基因变异以外，还有转录、翻译、表观遗传(epigenetics)、构象、调节和功能的变化等。基因是复杂的，而不是单一的。一种疾病所涉及的基因绝不是一种，而是多种，疾病的发生和发展是多种基因和功能的综合改变结果。基因的变异是多样的，而不仅仅是单个核苷酸的改变。除了单核苷酸的改变，还有插入、移码、重复等；更有转录、修饰、翻译、表达、代谢、调节和功能的变化。基因是基本的，但不是全部的。基因是分子生物学和遗传学的基础，在人生命活动和疾病发生中占有特殊地位，但不是全部的。基因还有其上游
20、和下游，还有代谢和调节等等。除了基因以外，基因的上游和下游也在疾病的发生中起着十分重要的作用，甚至在一些条件下，起关键性作用。我们是基因论者，但不是唯基因论者。,重视基因 不唯基因,基因的改变是动态的，而不是静止的。在疾病的发生和发展过程中，基因的改变，特别是表达、功能、代谢和条件的变化都是动态的，而不是静止不变的。一种疾病的关键基因，不是几个基因，是几十个，甚至包括成百上千个基因结构或功能的改变。不同疾病，不同个体，不同阶段，所涉及的基因的改变亦不同。预测一种疾病，可能不是几个基因和marker，而需要几十甚至几百个marker，才能确定。对疾病特别是复杂疾病，我们不能太简单，太机械了。最近国际基因组研究团队在冷泉港开会，研究、调整、部署下一阶段基因组计划。提出应以“外显子”为全基因组分析的中心。因为已发现多数与疾病相关联的基因变异都发生在外显子，而且外显子数量少，功能明确，分析相对容易、经济。但是，基因的改变，不仅在外显子，更不限于单核苷酸序列的变化，在内含子、非编码区，特别有功能的非编码区的结构和功能改变亦是十分重要的。最近Science发表了一种非编码区功能分析的新方法，亦是值得探索和研究。,GWAS应与基因功能研究结合起来,小结单基因病致病基因的克隆复杂疾病疾病易感基因与区域的筛选与确定GWAS的优点与不足,谢谢！,
