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1、第四章 细胞反应过程动力学,2,4.1.1 简介,一个活的细胞=一个复杂的化学反应器,化学反应的一些概念也可以应用到生物系统中来。,4.1 化学计量学,化学反应,3,代谢：细胞内发生的所有化学反应的总和称代谢,分解代谢 营养物的降解,合成代谢,4,培养基组成=营养物的降解,细胞为了生长和繁殖，必须消耗培养基中的营养成分用于合成细胞壁，蛋白质，酶，脂肪等物质和细胞构成单元。,元素的基本来源,5,产物合成,醇(乙醇),有机酸(乳酸,柠檬酸,氨酸酸),抗生素,酶,这些物质的大量合成，对于微生物细胞的正常功能维持可能是没有必要的或者是无用的，但对于人类却是很有价值的。,6,Cell Growth An
2、d Energy Release,Energy obtained from environment is stored and shuttled in high-energy intermediates,such as ATP,The cell uses this energy to perform three types of work:,Chemical synthesis of large or complex molecules;,Transport of ionic and neutral substrates into or out of the cell or its inter
3、nal organelles;,Mechanical work required for cell division and motion.,All these processes are,by themselves,nonspontaneous,and result an increase of free energy of the cell.Consequently,they occur when simultaneously coupled to another process which has a negative free energy change of greater magn
4、itude.,7,Example:Oxidation-Reduction,8,(II)化学计量学 得率系数,Simplest Macroscopic View of Growth,System:Fixed Amount of Cell Material,9,(a)元素平衡,Consider the following simplified biological conversion in which no extracellular products other than H2O and CO2:,一个典型的细胞组成可以表示为：,We postulate one mole of biologi
5、cal material would be defined as the amount containing one mole of carbon,such as,where:1mole of carbohydrate;:1mole of cellular material.,10,Simple elemental balances on C,H,O and N yield the following equations:,11,(b)Other Definitions,The yield coefficients,12,Regularity,Some parameters are nearl
6、y the same irrespective of the species or substrate involved:,0.462 g carbon in biomass per gram of dry biomass;typical bacteria composition:CH1.8O0.5N0.2,And most measured values of YX/S for aerobic growth on glucose are 0.380.51 g DW/g glucose.,13,YX/S值保持不变的条件：化学合成培养基唯一碳源无胞外产物或生长偶联型胞内不积累贮藏性能源物质YX/
7、S的应用在实际发酵过程中常常随不同生理状态而变化明确底物的消耗状况跟踪营养物的流向,14,4.2 细胞生长动力学概述,决定细胞反应动力学的主要因素、现象及其相互关系,非生命体系,生命体系,在细胞生长的过程中，包含两个相互作用的系统：培养环境细胞体,15,非生命体系,生命体系,细胞消耗营养成分，将培养环境中的底物转化为产物。,细胞在生命活动中产生热量，与此同时，通过设置培养环境的温度控制细胞的生长或产物合成。,细胞生长、增殖和代谢产物的积累，使培养环境的流变学性质(固含量、粘度)发生改变，细胞与培养环境之间的机械相互作用趋于明显，对于动物细胞培养过程的影响尤为显著。,16,4.2 生长动力学的定
8、量描述,对发酵过程的动力学描述不仅对于理论研究很有用，而且能应用于实际优化发酵过程和反应器的设计之中.,对研究系统中的各变量变化过程进行数学描述.,平衡方程,(物料衡算,能量衡算),热力学,(状态方程,亨利定理),反应速率方程,(传质,细胞和产物合成速率、底物的消耗速率),17,4.2.1 平衡方程,平衡方程的一般形式,体系中的积累速率:,细胞浓度:X(kg m-3),反应器体积:V(m3),细胞的质量:VX(kg),细胞的积累速率=(kgh-1),单位体积细胞的积累速率,=(kgm-3h-1),体系中的积累速率流入体系的速率-流出体系的速率,18,流入速率与流出速率:,where F 体积流
9、量(m3h-1)FX 质量流量(kgh-1)V 反应器体积(m3),下标,i or o,表示流入(input)或流出(output)反应器的变量.,合成速率与消耗速率:,细胞合成速率=rX(kgm-3h-1),产物合成速率=rP(kgm-3h-1),底物消耗速率=rS(kgm-3h-1),19,4.2.2 动力学模型,非分离模型,分离模型,非结构模型,结构模型,对细胞生长过程的不同理解产生了不同的动力学模型,是否分别描述细胞的各种组成成分,是否将细胞看成是均一的种群,20,非结构模型,结构模型,将细胞种群看成是均一单一组分的溶质,Single component heterogeneous i
10、ndividual cells,Multicomponent average cell description,将细胞种群看成是多组分多种群的生物系统,最理想的模型,最接近现实的模型,对细胞生长过程的不同理解产生了不同的动力学模型,非分离模型,分离模型,21,生长速率(kg m-3 h-1)底物消耗速率(kg m-3 h-1)产物合成速率(kg m-3 h-1),符号定义,比生长速率(h-1)底物比消耗速率(h-1)产物比合成速率(h-1),22,细胞生长动力学(X),产物合成动力学(P),底物消耗动力学(S),细胞反应动力学,23,细胞生长与抑制,底物限制生长,假定一种化合物S是限制性底物(
11、即S的浓度增加会影响生长速率,而其它营养组分浓度的变化对生长速率没有影响作用).,a)Monod 方程,假设条件：均衡生长只有一种限制性基质细胞得率系数为常数,24,where 比生长速率(h-1)最大比生长速率(h-1)饱和常数(kgm-3),典型的非结构非分离动力学模型是Monod equation,它的方程表达形式类似于酶的Michaelis-Menten 方程:,半经验公式,25,类似于酶反应动力学所提示的规律,从Monod方程也可以推衍出一些有用的结论：,优点:Monod 方程能适合于许多实验和生产过程中的微生物生长过程，适用面较广。,缺点:,a.仅适用于生长速率较慢的情况,b.仅适
12、用于细胞浓度较低的条件,26,对于快速生长密度较高的微生物培养过程:,or,where S0 底物的初始浓度 KS0 无纲量系数,其它方程:,优点:对实验数据的拟合效果优于Monod方程;缺点:方程不连续.,Blackman equation,Tessier 方程,27,Moser 方程,当 n=1 和Monod方程等效.,Contois 方程,一般形式下的微分方程:,28,General form,a single differential equation:,Constants of the Generalized Differential Specific Growth Rate Equ
13、ation for Different Models,29,生长非偶联型(次级代谢物),产物合成动力学,生长偶联型(乙醇发酵),or,or,30,Leudeking-Piret 方程,生长半偶联型:(乳酸发酵),or,It has proved extremely useful and versatile in fitting product formation data from many different fermentations.This is an expected kinetic form when the product is the result of energy-yiel
14、ding metabolism,as in several anaerobic fermentations.,31,内源性的代谢维持,系数范围:ms=0.024(kg 底物/kg 细胞h-1),在微生物不生长也不生产产物时，仍消耗底物，这是为了满足微生物的维持需要，支持细胞存活、细胞运动、酶合成、渗透压、营养贮存和其它过程。,32,底物消耗动力学,where the expressions of rPi could be one of the above three product formation rate equations,according to the characteristic
15、s of the corresponding product(growth-associated or not).,对于有许多产物合成的发酵过程，底物的消耗速率可以表示为：,Also,用于细胞生长,用于产物合成,代谢维持,33,细胞生长动力学(X),产物合成动力学(P),底物消耗动力学(S),细胞反应动力学,34,4.3 分批培养的动力学方程,生长条件是不稳定的，一直在变化的：随着细胞生长过程的进行，反应器中的营养物浓度，细胞浓度，产物浓度都随反应时间而变化。,S,X,P=f(t),这种培养方式很简单，因此广泛地在实验室和生产实践中应用。,35,4.3.1 Introduction,典型的大肠
16、杆菌生长曲线,生长曲线可分为4个时期.,36,37,延滞期,接种后，细胞的生长进入延滞期。这个期间是细胞的适应调整期，细胞在一个新的环境中生存，需要根据新环境的营养特点重新调整细胞体内的酶系及代谢过程，以使自身能适应新的环境并开始生长和繁殖。,怎样减少延滞期的时间?,可以让细胞有一个预适应的过程，种子的二级培养。,种龄是对数期的（年青，有生命力）,加大接种量,优化培养基的培养条件（化学组成和物理条件）,加入一些生长因子（微量元素，维生素等）,38,当培养基中含有2种碳源时，可能会有多个延滞期的出现。,这种现象称为二次生长.,当一种碳源被利用完后，细胞还需重新调整细胞体内的酶系和代谢途径以适应另
17、一种碳源的利用，这需要一个调整的过程。,二次生长,39,对数生长期(Exponential Growth Phase),延滞期结束后，微生物适应了新的环境，其生长过程进入倍增生长的过程，生物量或微生物的数目随着分裂周期而倍增。,对数生长速率方程符合一级动力学方程,with X=X0,at t=0=constant,积分得到,or,对数生长的特征是：在半对数坐标系中，以lnX 对 t 作图,得到一条直线。,40,细胞的倍增时间:,t,t,lnX,X,41,稳定期,在稳定期时,细胞的净生长速率为0,即生长速率=死亡速率,但是在稳定期时，细胞仍保持着代谢活力并合成次级代谢产物,（非偶联型代谢产物）.
18、,死亡期,在稳定期结束时，随着营养物耗竭，或者是有害代谢副产物的积累，导致细胞的生长进入死亡期。,细胞的死亡速率一般遵循一级反应动力学,积分得到,where,Xv 活细胞浓度,XS是稳定期时的细胞浓度,42,4.3.2 分批发酵动力学(是一个非稳态的过程),对于分批培养:Fi=Fo=0,then dV/dt=0,where rSX 用于细胞生长的底物消耗;rSm用于代谢维持的底物消耗 rSP用于产物合成的底物消耗,43,细胞生长速率:,产物合成速率:,底物消耗速率:,当代谢维持可以忽略时.,注意：不是一个常数,44,应用Monod 方程并且不考虑产物的合成，也不考虑代谢维持，只考虑细胞的生长和
19、底物的消耗时（简化模型）,(比生长速率),(细胞对底物得率),这时，YX/S是一个恒定值，且,45,46,If X00,then,对于分批培养,47,4.4 参数估计,积分法,微分法,实验测得S(t),X(t),求解微分方程组,线性化或数值解,实验测得反应速率，直接由速率方程估计参数,48,4.4.1 积分法,仅能应用于简单的动力学模型First-order kineticsZero-order kineticsGrowth associated product accumulationLogistic equationMonod equation,49,Monod方程的解析解,(1),(2)
20、,(3),将(3)代入(2)得：,(4),50,将(1)式变形,(5),将(5)式代入(4)式得：,(6),分离变量后积分得：,式中A和B是与动力学参数有关的复合参数。,51,4.4.2 微分法,比生长速率,实验数据,X-t,S-t,-t,线性化,52,t,X,S,S,1/S,S,S/,1/,1/max,-1/KS,KS/max,1/max,KS/max,-KS,53,数值计算求解,非线性微分方程的数值求解,Runge-Kutta method,(Matlab命令:ode45,ode23.)优化计算依赖域法 或 遗传算法(commands in Matlab:lsqnonlin,fmincon
21、,lsqcurvefit),Least-squares method(最小二乘法),54,积分法微分法,S(t),X(t),例4-1 Monod 方程参数的实验测定：以乳糖为唯一碳源分批培养细菌，底物消耗与菌体生物量的过程曲线数据如表4A所示(Page162)。假设菌体生长符合Monod方程。,55,4.5 细胞反应动力学的结构模型,结构模型(Structured Model)分离模型(Segregated Model),56,I.结构模型,葡萄糖GE,磷酸盐PE,胞内磷酸盐P,贮藏性碳源C,高能磷酸化合物E,结构性生物质B,葡萄糖G,次级代谢产物L,rP,rC,rE,rB,rL,rEB,rP
22、,ext,rG,ext,57,II.分离模型,许多微生物在生长过程中，当细胞成熟到一定阶段后才能产生产物，而另一部分不能产生产物。根据细胞成熟与否将细胞分为二个种群（未成熟的X1和成熟的X2），而成熟的细胞X2能繁殖成为未成熟细胞并产生产物。,假设成熟的过程符合一级反应动力学，而细胞繁殖的过程符合Monod方程，产物的合成与成熟细胞的生长相关。则由右图的物理模型可得：,XX1+X2,58,III.代谢模型,在代谢过程中，假设：人为地将酵母分为两部分A和B一方面，A部分酵母利用消耗葡萄糖产生乙醇、能量并生长形成B部分酵母另一方面，A部分酵母消耗乙醇产生能量和生长形成B部分酵母B部分酵母以一定的速率转化为A部分酵母（符合一级反应动力学）,59,根据上面的代谢结构图，可以写出方程,式中，rA,rB,rC 是三个过程的生长速率(见上一页的模型图)a1,a2,a3为各自的得率系数,式中，KS和KE是酵母A分别以葡萄糖和乙醇为基质生长时的饱和常数 mm1和mm2是酵母A分别以葡萄糖和乙醇为基质生长时的最大比生长速率 k是B转化为A的速率常数,
