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1、,结核病实验室诊断技术新进展 山东省结核病防治中心 王海英,主要内容,结核病实验室常用的诊断技术和方法结核病实验室新的诊断技术和方法未来实验室结核病的诊断模式,2,1、细菌学方法 2、免疫学方法 3、分子生物学方法,3,3,一、目前实验室常用检测方法,1、细菌学方法（抗酸染色双目显微镜、固体或液体培养）,4,4,一、目前实验室常用检测方法,2、免疫学方法 抗体检测是结核病辅助诊断手段，对菌阴肺结核有一定的参考价值。1、酶联免疫吸附试验 2、免疫胶体金标技术,5,5,一、目前实验室常用检测方法,6,7,潜伏结核感染者的筛查结核菌素PPD试验,3、分子生物学方法 实时荧光定量PCR技术：也称分子信
2、标技术，是今年发展起来的核酸定量技术。是PCR与核酸探针技术的结合，将PCR较高的灵敏度和核酸探针的高特异性相结合。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。,8,8,一、目前实验室常用检测方法,9,9,二、新诊断技术和方法,分类 新方法 用途 细菌学检
3、查 LED(发光二极管显微镜)涂片检查 免疫学方法-干扰素释放实验 潜伏感染者分子生物学 LAMP(等温扩增)涂阴涂阳 LPA(线性探针)MDR-TB,鉴定 Genechip(基因芯片)MDR-TB,鉴定 GeneXpert(多色巢式定量PCR)耐RFP,涂阴 分子分型技术 指纹图谱分析 其他 DNA 测序法 突变检测 HPLC 胞壁成分检测,10,10,二、新诊断技术和方法,1、细菌学检查 发光二极管（LED）荧光显微镜光源寿命长（30,000h）不需要预热不需要暗室可用现有的显微镜可使用电池电源与通常荧光显微镜的判定一致率98.0%,两种方法观察结果,Z-N染色镜检结果,LED镜检结果,二
4、、新诊断技术和方法,中盖项目LED评估结果,初诊患者LED涂阳患者检出率为14.96%（552/3691），萋尼氏染色明场显微镜涂阳患者检出率12.46%(460/3691)，前者较后者提高2.5个百分点（P=0.000）随访患者LED和明场显微镜的检出率分别为7.09%(178/2509)和2.83%（71/2509)，提高4.26个百分点（P=0.000）,中盖项目LED评估结果,读片时间LED 读片时间120.0338.88秒，明场显微镜206.3175.86秒（p=0.00）使用接受度调查对于进一步推广建议，大多数(8/9)认为应进一步推广，但其中有2人认为应在日工作量大的实验室优先使
5、用,14,14,二、新诊断技术和方法,2、免疫学方法：-干扰素释放实验,BCG进化过程,16,16,二、新诊断技术和方法,分子生物学 LAMP(等温扩增)LPA(线性探针)Genechip(基因芯片)GeneXpert(多色巢式定量PCR)分子分型技术,17,17,二、新诊断技术和方法,（1）环介导等温扩增技术(Loop mediated isothermal amplification，LAMP)：Eiken,Japan,可同时检测患者是否感染结核 所用仪器设备极其简单 63 扩增（避免非特异性扩增 多对引物（提高特异性和速度）：靶基因6个不同区域，设计4种引物对涂阴培阳病人具有非常高的敏感
6、性和特异性密闭系统(没有污染的风险）快速，两小时内即可得到检测结果，肉眼观察,18,18,二、新诊断技术和方法,（1）环介导等温扩增技术(Loop mediated isothermal amplification，LAMP),PCR,LAMP,需要使用PCR扩增仪设计特异性的两条引物扩增效率:107,不需要使用PCR扩增仪多对引物保证扩增的特异性扩增效率:1010,二、新诊断技术和方法,（1）环介导等温扩增技术(Loop mediated isothermal amplification，LAMP),19,20,20,二、新诊断技术和方法,3、分子生物学（2）线性探针检测技术（LPA）,可进
7、行结核杆菌复合群的鉴定可用于MDR-TB高危人群的筛查对利福平的抗药性(通过检测rpoB基因的最常见突变)对异烟肼的抗药性(通过检测katG基因和inhA基因的最常见突变)检测的样本可以是纯培养物或是涂片阳性的痰标本内部控制保证了结果的正确可以获得商品化的试剂盒约五小时内即可得到检测结果需要配备生物安全柜的生物安全二级实验室需要至少三间房子,Who policy statement，June 2008,21,21,二、新诊断技术和方法,3、分子生物学（2）线性探针检测技术（LPA）,耐药分子诊断的基本原理,利福平/异烟肼耐药性的产生与结核分枝杆菌特定基因某些位点的突变相关。,22,22,DNA
8、提取标本 固体或液体培养基培养的菌种 抗酸染色涂片阳性标本方法 超声波裂解 GenoLyse试剂盒,0.51 h,23,23,PCR扩增不同标本,扩增参数不同 培养菌种：扩增20个循环 涂阳标本：扩增30个循环引物：生物素标记多重PCR扩增,2.5 3h,24,24,杂 交采用反向杂交法:PCR扩增产物变性（DNA成单链）与线性探针杂交洗涤显色判断结果,1 2h,25,25,结果判读,0.5h,中盖项目线性探针检测利福平评价,WHO POLICY STATEMENT 27 JUNE 2008通过系统评估和META分析（和DST比较）：结核分枝杆菌或涂阳的痰标本RIP：敏感性97%，特异性99%
9、,中盖项目线性探针检测异烟肼评价,WHO POLICY STATEMENT 27 JUNE 2008通过系统评估和META分析（和DST比较）：结核分枝杆菌或涂阳的痰标本INH：敏感性90%，特异性99%,中盖项目线性探针检测MDR评价,WHO POLICY STATEMENT 27 JUNE 2008通过系统评估和META分析（和DST比较）：结核分枝杆菌或涂阳的痰标本MDR-TB检测准确性：99%。,WHO POLICY STATEMENT 27 JUNE 2008,county level.线性探针分析不能替代目前传统的培养和药敏试验，涂阴标本和XDR-TB的证实都需要进行传统的培养。,
10、29,基因芯片,基因芯片指采用光导原位合成或微量点样等方法，将核酸片段有序地固化于支持物的表面，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。,二、新诊断技术和方法,（3）Genechip(基因芯片),30,检测过程,二、新诊断技术和方法,（3）Genechip(基因芯片),31,芯片结果图例,芯片杂交质控,二、新诊断技术和方法,（3）Genechip(基因芯片),32,33,33,二、新诊断技术和方法,（3）Genechip(基因芯片)结核耐药检测基因芯片,International Journal of T
11、uberculosis and Lung Disease,13:914-920,2009（IF=2.3）,是一种半定量巢式实时PCR的检测方法，能检测杆菌和利福平耐药性。扩增出ropB基因含有81bp的核心区序列，探针能够区分野生型基因序列与突变型基因序列。集样本准备、扩增和实时检测于一体。盒子中含有冻干的试剂，缓冲液和洗涤液。使用6色激光检测装置对靶核酸进行实时检测。,二、新诊断技术和方法,（4）GeneXpert(多色巢式定量PCR)检测技术,34,标本类型：临床痰标本，或浓缩处理后的标本（涂阳或涂阴培阳），不能用于用于治疗随访的病人。对涂阴培阳病人具有非常高的敏感性和特异性可同时检测患者
12、是否结核以及是否对利福平耐药 两小时内即可得到检测结果，所用仪器设备简单不需要生物安全柜，满足涂片试验条件的实验室,二、新诊断技术和方法,（4）GeneXpert(多色巢式定量PCR)检测技术,35,利福平耐药阴性预测值：在结核病利福平耐药流行低或高的地区，NPV大于99%.即阴性结果能排除RIP耐药利福平耐药阳性预测值：RIP耐药流行15%，PPV90%RIP耐药流行5%10%，PPV：71%84%RIP耐药流行5%，PPV：70%，在这种情况下，RIP耐药的结果需要传统的DST证实。,二、新诊断技术和方法,（4）GeneXpert(多色巢式定量PCR)检测技术,36,基于核酸扩增的一步法利
13、福平耐药检测,Xpert TM MTB/Rif,技术平台利福平的耐药性分析 喹诺酮类药物耐药性 HIV 病毒载量分析,自动化得标本处理和检测，可以在2小时内出结果,二、新诊断技术和方法,（4）GeneXpert(多色巢式定量PCR)检测技术,38,38,结核分枝杆菌菌株水平鉴定最早采用生化分析、血清学技术和噬菌体分型等技术进行分析，但由于这些方法的局限性而未得到广泛应用。基于核酸基础上的分子流行病学研究技术是对结核病等感染性疾病进行检测的一个强有力的手段，可以进行结核菌传播的研究，结核病实验室交叉污染的研究，判断结核再感染或复发以及国际间传播的研究。,二、新诊断技术和方法,（5）分子分型技术,
14、39,39,简单介绍以下三种分型技术：（1）插入序列 6110 限制性片段长度多态性分析：IS6110（2）直接重复片段及寡核苷酸多态性分型：间隔寡核苷酸分 型(spacer oligonucleotide typing,Spoligotyping)（3）分枝杆菌分散重复单元-可变数目串联重复序列：(mycobacterial interspersed repetitive units-variable number tandem repeats,MIRU-VNTR),二、新诊断技术和方法,3、分子生物学（5）分子分型技术,40,40,插入序列 6110 限制性片段长度多态性分析：IS6110
15、是一个只存在于结核分枝杆菌复合群基因组中的插入序列，长度为1355bp，具有高度的保守性，属于IS3家族。不同结核菌株IS6110的数目和位置不同。在IS6110序列中，限制性内切酶PvuII的酶切位点只有一个，经酶切后产生大小两个不同的片段，再与只针对酶切位点右侧的245bp探针杂交，则杂交后产生的条带数即为菌株IS6110拷贝数。,二、新诊断技术和方法,（5）分子分型技术,41,41,插入序列 6110 限制性片段长度多态性分析：IS6110这种方法存在一定的缺陷：对于基因组中IS6110低拷贝6或缺陷的分辨能力有限；需要大量的基因组DNA，操作步骤繁琐且工作量大；各实验室所采用的IS61
16、10-RFLP分型方法的标准不统一，不同实验室的IS6110-RFLP分型结果难于进行比对。,二、新诊断技术和方法,（5）分子分型技术,42,42,直接重复片段及寡核苷酸多态性分型：基于直接重复区（RD区）的多态性。DR区只出现于结核分枝杆菌复合群中。由若干个保守的长为36bp的直接重复序列组成，并被非重复序列即间隔区分开。每隔间隔区序列长为34-41bp。通常间隔区的顺序在所有菌株都是相同的，但可能发生某一间隔区的插入或缺失，因此利用Spoligotyping就可以对结核分支杆菌进行株水平的鉴定。可以区分结核分枝杆菌复合群和M.bovis以及M.bovis BCG,二、新诊断技术和方法,（5
17、）分子分型技术,43,43,直接重复片段及寡核苷酸多态性分型：Spoligotyping该方法对菌株的分辨能力明显弱于IS6110一RFLP方法，特别是不能有效分辨北京家族菌株，而在我国目前流行的结核菌株中，大约50%属于北京家族；同时与其他方法相比有高估菌株间流行病学联系的倾向。,二、新诊断技术和方法,3、分子生物学,44,44,可变数目串联重复序列：MIRU-VNTR 该技术是近年发展起来的以PCR为基础的分型技术。MIRU为40-100bp的DNA元件，通常以串联重复形式散步于结核分枝杆菌复合群基因中。H37Rv基因组中含41个MIRU区，其中有12个区具有多态性，其拷贝数在不同菌株之间
18、12个区拷贝数在不同菌株之间存在差异。MIRU技术利用不同菌株之间这12个区拷贝数的差异达到鉴定菌株的目的。,二、新诊断技术和方法,3、分子生物学,45,45,可变数目串联重复序列：MIRU-VNTR 该方法操作简单,分辨率高,结果容易分析,具有很高的可重复性,在实验室内和实验室间具有非常好的可比性,并能提供数字化的分型信息,适宜于进行大量样本和网络化分析。,二、新诊断技术和方法,3、分子生物学（5）分子分型技术,46,46,DNA测序法被认为是检测变异的“金标准”，可检测出待检基因上的所有突变位置和突变情况。已用于RFP、INH、PZA、EMB等耐药基因的检测。缺陷：专业设备，专业技术，限制其广泛应用。,二、新诊断技术和方法,4、其他（1）DNA测序法,47,47,在应用某项新技术时，需要考虑的一般性问题：是否有足够的经过培训的人员有效的实验室质量管理体制能否得到备用设备和耗材技术支持的可获得程度工作环境的条件 等等,二、新诊断技术和方法,未来实验室的诊断模式,结核病实验室未来检测模式,未来实验室的诊断模式,以病人为中心的实验室诊断技术平台,传统方法/新诊断技术,确定治疗方案,51,The End,Thank you！,
