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1、酵母的制备、鉴定及含量测定,结构简介,二、实验原理,选材：提取和制备RNA的首要问题是选RNA含量高的材料。微生物是工业上大量生产核酸的原料，其中RNA的提制以酵母最为理想，因为酵母核酸中主要是RNA（2.6710.0%），DNA很少（0.030.516），而且菌体容易收集，RNA也易于分离。此外，抽提后的菌体蛋白质（占干菌体的50%）仍具有很高的应用价值。,提取,注意：所有的组织中均存在RNA酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染,因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200（180）烘烤2小时以上。RNA提制过程首先要使RNA从细
2、胞中释放，并使它和蛋白质分离，然后将菌体除去。再根据核酸在等电点时溶解度最小的性质，将pH调至2.02.5，使RNA沉淀，进行离心收集。然后运用RNA不溶于有机溶剂乙醇的特性，以乙醇洗涤RNA沉淀。,提取方法,简单地讲，核酸抽提包含样品的裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯化则是使核酸与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。RNA的 pI2.02.5DNA？,实验室法：苯酚法、去污剂法和盐酸胍法、稀盐溶液提取法 0.14mol/L 其中苯酚法又是实验室最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被苯酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留
3、在苯酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出。此法能较好地除去DNA和蛋白质，提取的RNA具有生物活性。工业法：稀碱法或浓盐法,RNA的鉴定,含氮碱基：嘌呤能与Ag(NH3)2+中的银结合生成溶解度很小的嘌呤银盐沉淀，从而鉴定嘌呤的存在。戊糖：核糖与强酸共热生成糠醛，后者与地衣酚(3，5二硝基甲苯)反应，缩合成绿色化合物，以此鉴定戊糖的存在。磷酸：在酸性溶液中磷酸与钼酸作用生成磷钼酸。后者当有还原刑(如抗杯血酸、氯化亚锡等)存在时，立即转变成蓝色的还原产物。钼蓝反应极为灵敏，微量杂质的磷、硅酸盐、铁离子以及强度偏高或偏低都会影响测定结果。因此实验用的器皿需要特别清洁。,三、实验材料
4、、主要仪器和试剂,1实验材料干酵母粉、pH0.55.0的精密试纸；冰块。2主要仪器（1）药物天平（2）三角瓶（100mL）（3）量筒（50mL）（4）水浴锅（5）电炉（6）试管木夹（7）离心管（8）离心机（4 000r/min）（9）烧杯（250mL,50mL,10mL）（10）滴管及玻棒（11）吸滤瓶（500mL）（12）布氏漏斗（60mm）（13）表面皿（8cm）（14）烘箱（15）干燥器（16）紫外可见分光光度计,1、试剂 1.5mol/l硫酸溶液、地衣酚试剂、1%AgNO3溶液、浓氨水、等,四、操作方法,（一）、RNA的制备 1提取活性干酵母粉5g，倒入100mL三角瓶中，加NaCl
5、5g，水50mL，搅拌均匀，置于沸水浴中提取1h。2分离将上述提取液取出，立即用自来水冷却，装入大离心管内，以3 500r/min离心10min，使提取液与菌体残渣等分离。,3沉淀RNA将离心得到的上清液倾于50mL烧杯中，并置于放有冰块的250mL烧杯中冷却，待冷至10以下时，用6mol/L HCl小心地调节pH至2.02.5。随着pH下降，溶液中白色沉淀逐渐增加，到等电点时沉淀量最多（注意严格控制pH）。调好后继续于冰水中静置10min，使沉淀充分，颗粒变大。4抽滤和洗涤,上述悬浮液以3 000r/min离心10min，得到RNA沉淀。将沉淀物放在10mL小烧杯内，用95的乙醇510mL充
6、分搅拌洗涤，然后在铺有已称重滤纸的布氏漏斗上用真空泵抽气过滤，再用95乙醇510mL淋洗3次。由于RNA不溶于乙醇，洗涤不仅可脱水，使沉淀物疏松，便于过滤、干燥，而且可除去可溶性的脂类及色素等杂质，提高了制品的纯度。5干燥从布氏漏斗上取下有沉淀物的滤纸，放在8cm表面皿上，置于80烘箱内干燥。将干燥后的RNA制品称重。,（二）RNA的鉴定,水解RNA：取0.51g提取的核酸，加入10%硫酸10mL沸水浴加热10分钟制成水解液，然后进行组份鉴定。1、取冷却后的RNA水解液0.5ml，加入0.5ml的浓氨水，再加入1ml1%的AgNO3溶液，观察有无沉淀生成。2、取RNA水解液1ml，加入1ml 地衣酚溶液，于沸水浴中加热15分钟，观察溶液颜色的变化。（3）磷酸：取一支试管，加入2mL水解液，然后加入5滴硝酸银和1mL钼酸铵溶液后，在沸水浴中加热，观察有无黄色磷钼酸铵沉淀。,
