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1、寄生虫样本的采集、制作及保存深圳市疾病预防控制中心二O一O年十一月,寄生虫样本的概念：指用于标本制作、保种、冷藏的寄生虫不同生活史阶段的虫体材料、遗传材料及相关的生物材料，是寄生虫种质资源的实物资源。,一、寄生虫样本的采集：掌握基本知识：了解人体寄生虫的形态、生活史 和生态以及地域分布等有关知识。1、样本来源：2、采集时注意事项：,1、样本来源：肠道、腔道内的蠕虫卵、原虫滋养体或包囊：排泄物、分泌物 肠道内的蠕虫成虫：药物驱出 血液、骨髓内的寄生虫：抽取血液和骨髓穿刺 肝、肺、肌肉等组织内的寄生虫：穿刺、活检组织作切片 有些难以采到的寄生虫：动物接种及人工培养增殖,2、采集时注意事项：详细的样
2、本记录：保持样本的完整：防止自身感染：,二、寄生虫样本的制作和保存：1、尽快适当处理：2、固定方法：3、常见的固定液：4、固定后的处理保存：5、特殊用途的样本处理：,1、尽快适当处理：进行人工饲养。及时感染动物进行保种。需制作玻片标本时，先用0.85%生理盐水将虫体粘附的污物 洗净，固定后制作玻片标本。如条件所限不能对样本及时处理，应立即将样本放入4冰 箱内，但时间不能过久，以免虫体腐烂。,2、固定方法：固定处理使虫体在短时间内迅速死亡，保持虫体标本原有的姿态，并使虫体内的物质(如蛋白质、脂肪和糖类等)凝固，防止腐烂和自溶，保证虫体内部结构完整并易于着色。无论是新鲜虫体还是病变组织，固定越及时
3、越好。常用的固定方法有物理固定与化学固定两种。物理固定：以加热和干燥方法固定标本。化学固定：用某些化学药品配成溶液来固定标本，这些溶 液叫做固定液。固定时将标本浸于固定液内。,3、常见的固定液：常用于配制固定液的试剂有甲醛、乙醇、升汞、苦味酸、冰醋酸等。固定液分为单纯固定液与复合固定液两种。单纯固定液配制简单，使用方便，但均不能兼备各种试剂的优点，因此较少应用。复合固定液由两种以上化学药品配制而成，可利用各种药品的优点以互补不足，例如醋酸会使细胞膨胀，而乙醇与苦味酸反使细胞收缩，两者混合使用，可使收缩和膨胀作用抵消。,单纯固定液：甲醛：具有较强的杀菌效果，能保存标本免于腐烂。由于其渗透力较强，
4、有硬化标本的性能，故准备切片的活检组织多用此固定液保存。乙醇：为无色液体,具有固定、保存和硬化标本的性能，渗透力强，其主要缺点在于吸收水分，能使标本收缩。由于乙醇可使虫体或组织收缩，表面硬化，因而较难渗入到组织深部，所以不宜固定大块组织。乙醇除了固定和保存虫体以外，还在制片过程中用于脱水。,复合固定液：鲍恩氏(Bouin)固定液：含苦味酸饱和水溶液75份,甲醛25份,冰醋酸5份。固定时间312 h，或过夜。临用时配制，不宜久藏。该固定液适用于一般小型蠕虫的固定。劳氏(Looss)固定液：含升汞饱和水溶液100 ml，醋酸2 ml。适用于固定小型吸虫，固定424 h。肖氏(Schaudinn)固
5、定液：含升汞饱和水溶液2份，95%乙醇1份，每100 ml混合液中加入冰醋酸510 ml。适用于固定肠原虫涂片，固定1060 min。布莱氏(Bless)固定液：含70%乙醇90 ml、40%甲醛7 ml、冰醋酸3 ml。此固定液渗透力强，为昆虫幼虫的良好固定剂，亦可固定小型吸虫和绦虫。,4、固定后的处理保存：样本经固定后，视样本的种类、大小以及固定液的种类不同，后处理的方法也不尽相同。用任何保存液(如5%甲醛液或70%乙醇)固定后的虫体，须在1周内重新更换于新的保存液内保存，换液的目的是防止药液被稀释而影响保存虫体的效果。一般固定的标本应保存于紧塞的瓶中，并注明标本的来源、名称、保存液、日期
6、和采集人姓名，存放于阴暗处备用。,5、特殊用途的样本处理：样本准备开展分子生物学研究，如提取 DNA等，需对样本进行特殊处理。将现场采集的蠕虫(活虫)成虫、幼虫或虫卵,可选用以下固定方法进行保存：固定于20%二甲基亚砜(DMSO)饱和盐水溶液中存放4保存；直接固定于100%无水乙醇；可将活虫体直接保存于-70冰箱中。含虫体的粪便标本：现场采集的粪便(内含虫卵、幼虫或原虫时)可选用：如短期保存,可直接保存于4冰箱或-70干冰中；如长期保存，可将粪便与无水乙醇11混合后4保存或与重铬酸钾11混合后4保存。含虫体的血液标本：现场采集的血液标本(如内含原虫,未服用过药物)，可以15 ml血液中加EDT
7、A 4保存，也可将56滴血采集在滤纸上，待干后可短期保存于4冰箱内。,三、常见寄生虫样本的采集、固定与保存：1、蠕虫样本：1 蠕虫成虫 1 蠕虫虫卵 2、原虫样本：2 肠道内原虫 2 腔道内原虫 2 组织内原虫 2 血清内原虫 3、医学昆虫样本：,1 蠕虫成虫样本：采集：可用驱虫药物自宿主的消化道驱出虫体，或解剖自然感染和人工接种感染的动物及尸体解剖而获得虫体。清洗：采集到的虫体须将其体表附着物除去：放入0.85%盐水中洗涤。固定：吸虫：凡用含有升汞固定的标本会产生许多汞盐沉淀，沉积于组织内影响观察，故需用0.5%碘乙醇(似葡萄酒色)浸泡12 h，以除去汞盐沉淀，再放入70%乙醇中退去碘的颜色
8、，最后将虫体保存于70%乙醇中。绦虫：绦虫标本往往头节深埋肠粘膜中。从解剖动物肠管发现绦虫时，保持其完整。线虫：将虫体放入加热至6070的热水或乙醇等固定液中固定，可获得伸直的虫体，待冷却后移于70%80%乙醇或巴氏液(3%甲醛生理盐水)中保存。保存：保存虫体如暂不作检查，可在保存液(乙醇)中加入丙三醇数滴，以防止保存液的蒸发干涸。保存虫体标本的瓶、管内外均须贴标签，注明采集地点、采集日期、宿主名称、寄生部位、采集者以便查考。,1 蠕虫虫卵样本：采集和清洗：小型虫卵取粪便510 g,放入小烧杯内，加少量清水，调匀,通过80100目尼龙网筛过滤至含500 ml清水量杯中，静置3040 min后，
9、倾去上部浑浊液，再加水至500 ml静置30 min留沉淀物，再反复沉淀数次，直至上部水澄清。固定和保存：弃去上清液，加3%甲醛液与含虫卵沉淀粪渣混合进行固定24 h，然后再更换5%甲醛生理盐水中并加丙三醇数滴密封保存。大型虫卵水洗沉淀方法基本同上，区别为换以4060目尼龙网筛过滤粪液，每次换水后静置1525 min。固定保存方法同上。受精蛔虫卵和钩虫卵容易发育成胚胎，故固定时需用加热至70的10%甲醛进行处理，以阻止卵细胞继续发育。,2 肠道内原虫样本：采集：肠道内原虫如溶组织内阿米巴、结肠内阿米巴、布氏嗜碘阿米巴、迈氏唇鞭毛虫、兰氏贾第鞭毛虫、人毛滴虫、结肠小袋钎毛虫等。这些寄生虫生活史中
10、均有滋养体与包囊(人毛滴虫除外)两个时期。滋养体通常出现于液质或半液质以及含有粘液脓血之粪便内。包囊则见于成形或半成形的粪便中。收集粪便标本最好用特制的粪便盒或油纸。采取粪便务求新鲜。,固定与保存：当采到含有肠原虫新鲜标本时，无论是滋养体还是包囊，应立即制成涂片标本，用肖定氏固定液固定，再移置于70%乙醇内保存，以备日后染色制片观察。肠原虫滋养体在体外容易死亡分解，应趁新鲜及时涂片固定，包囊除了涂制玻片标本染色外，亦可保存于5%甲醛生理盐水中。保存方法：将含有原虫包囊较多的粪便用5%甲醛生理盐水调成悬液，经60目孔铜筛过滤于尖底量筒中，静置34 h后，倾去上清液，再换以新的5%甲醛生理盐倒入瓶
11、中保存。检查时，用吸管吸取此混悬液一滴置于载玻片上，复以盖玻片高倍镜检。如需染色检查时，可加入碘液1滴与粪液相混后检查。此法可保持包囊形态较长时间不变。,2 腔道内原虫样本：采集：腔道内原虫主要为阴道毛滴虫、齿龈内阿米巴及口腔毛滴虫。阴道毛滴虫：将收集的阴道分泌物接种于培养基内经培养使该原虫繁殖后涂制标本易检出。亦可取少量标本,不经培养直接涂片镜检，检出率较低。齿龈内阿米巴与口腔毛滴虫：两种原虫均寄生于口腔内,定居于齿龈组织、齿垢、蛀穴及齿槽脓疡内。采集时用牙签或小尖镊子挑取牙龈周围污垢物质，加一滴生理盐水于载玻片上调和均匀，置显微镜下检查。如标本虫数太少，通过人工培养法使虫体繁殖后涂制镜检,
12、可提高检出率。,固定与保存：阴道毛滴虫：取阴道分泌物在玻片上涂成薄膜，在空气中晾干，用甲醇固定后，即可短期保存，如用吉氏染液染色3060min，水洗晾干后即可长期保存。齿龈内阿米巴与口腔毛滴虫：取患者牙龈周围污垢物质加一小滴生理盐水和血清于载玻片中央调和均匀，使成一圆形薄膜，平置待尚未干燥而湿润时用肖定氏固定液固定，再移置于70%乙醇内保存，供日后染色制片、长期保存。,2 组织内原虫样本：组织内原虫主要为利什曼原虫和弓形虫。弓形虫寄生于单核白细胞、网状内皮细胞、神经细胞和其他组织细胞内，但有时也可游离于体液中。采集和固定：取急性患者的体液、脑脊液经离心沉淀,取沉渣作涂片，干燥后用甲醇固定。当虫
13、体较少时，可将待检体液或组织磨碎，加适量无菌生理盐水稀释或制成混悬液，注射于小白鼠腹腔内，约经过13周，取腹腔渗出液或小白鼠肝、脾、脑磨碎制成厚膜涂片，待自然干燥后用甲醇固定。保存：涂片经吉氏染液染色干燥后保存。,2 血清内原虫样本：血液内可查到的原虫有疟原虫、锥虫等。疟原虫的采集：耳垂或手指取血，用推片边缘中部取少许（0.51.0ul）血液在载玻片上推成薄血膜；再用推片的角，取血45ul，在同一载玻片上另一位置涂制成圆形厚血膜。制片和染色：自然干燥血膜，用甲醇固定薄血膜，厚血膜上加几滴清水溶去血红蛋白，吉氏染液染色。染色后，用水轻轻冲洗，晾干，室温保存备用。,3、医学昆虫样本：传播疟疾与利氏曼病的蚊与白蛉等成虫通常用针插好晾干，存放于昆虫盒内保存，盒内应放樟脑块以防虫蛀。蚊、白蛉、蝇等昆虫的卵、幼虫和蛹，以及蚤、虱、臭虫、蜱、螨等的发育各期均应保存于70%乙醇中。需要分离病原的昆虫常不作任何处理，收集于干净的试管或小瓶中保存。,Thanks,谢 谢！,
