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1、第十二章 核酸的生物合成,主要内容,一 DNA的生物合成二 RNA的生物合成,中心法则（central dogma）复制：是亲代双链DNA按碱基配对原则，准确形成两个相同核苷酸序列的子代DNA分子的过程。两条DNA链都可作为复制的模板。转录：是以一条DNA链为模板，将DNA链上储存的遗传信息按碱基配对原则准确转换成互补的mRNA的过程。翻译：是以mRNA为模板，将mRNA上的遗传信息转换成蛋白质的氨基酸序列的过程。中心法则：遗传信息由DNA mRNA Pro的流动途径。,中心法则：遗传信息由DNA mRNA Pro的流动途径。,补充和完善之处：A：RNA作为遗传物质能自我复制，并作为mRNA指
2、导Pro的合成。B：RNA能以逆转录的方式将遗传信息传递给DNA分子。,DNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的DNA分子。这样新形成的两个DNA分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。,一、DNA的生物合成,（一）半保留复制,15N DNA,14N-15N DNA,14N DNA,14N-15N DNA,1958年Meselson&stahl用同位素示踪标记加密度梯度离心技术实验,证明了DNA是采取半保留的方式进行复制.,DNA的半保
3、留复制实验依据,Meselson-stahl实验（a）密度梯度离心的DNA带（b）对应于左侧DNA带的解释,（二）DNA复制的起点和方向,复制叉（replication forks）：复制中的DNA分子，未复制的部分是亲代双螺旋，而复制好的部分是分开的，由两个子代双螺旋组成，复制正在进行的部分叫做复制叉。细胞内存在着能识别起始点的特种Pr。,方向：复制叉从起始点出发，沿DNA移动，移动方向与前导链的延长方向相同。复制可能是单向的，也可能是双向的，两个方向的复制速度不一定相同。大多数是双向的。眼状结构：线状DNA分子上的正在复制的部分形成；结构：环状DNA分子上的正在复制的部分形成。,DNA的双
4、向和单向复制,两种复制模式（a）单向复制模式（b）大肠杆菌染色体DNA双向复制模式,单向复制,i,双向复制,观察到的放射自显影图象,18%,质粒ColE1的单向复制示意图,单向复制,最早研究DNA复制起点和方向的是J.Cairns（1963年）。,型,DNA Replication,原核生物：只有一个复制原点。第二次复制可在第一次复制完成之前开始复制。真核生物；可在DNA链上的多个不同位点同时起始复制。所以真核生物的DNA复制速度比原核生物快些。,真核生物DNA的多起点复制,（三）DNA的复制过程（原核生物）DNA的合成是以四种脱氧核苷三磷酸即dATP、dGTP、dCTP、dTTP为前体，在D
5、NA聚合酶的催化下，向DNA的3OH端添加脱氧核苷酸，在DNA的3OH与添加的脱氧核苷酸的5磷酰基间形成3，5磷酸二酯键，反应中脱去一个焦磷酸基团。合成方向：5 3,添加到链上的每个核苷三磷酸是按照模板链的顺序由碱基互补配对原则选择的。反应的通式可写为：（NMP）n3OHdNTP（NMP）n13OHPPi,1、DNA聚合酶 pol(1)具5 3聚合酶活性 将脱氧核糖核苷三磷酸dNTP逐个添加到具有3OH末端的多核苷酸链上形成3，5磷酸二酯键。特点：A：底物为d NTP；B：DNA模板(3 5)；C：引物：RNA引物（带3羟基）；D：方向 5 3；F：产物DNA的性质与模板相同。,DNA聚合酶催
6、化的链延长反应,子链,3,5,模板链,(2)具有3 5端核酸外切酶的活性 有校对功能，能在3OH端将DNA链水解。以保证DNA复制的真实性。,DNA聚合酶的3-5外切酶水解位点,3,3,5,5,错配碱基,(3)具有5 3端核酸外切酶的活性 由5端水解DNA链，主要是切去一小段DNA，包括RNA引物和损伤DNA部分。pol主要功能：用于修复DNA双螺旋区中的单链区，这些单链区是在DNA复制时或DNA受损伤后留下的。活性高。,DNA聚合酶5-3外切酶活力,5-3核酸外切酶水解位点,单链缺口,5,2、DNA聚合酶 pol 具有3 5端核酸外切酶的活性，主要负责DNA的修复，在一定程度上参与DNA复制
7、。活性低。功能不十分清楚，是一种修复酶。,3、DNA聚合酶 pol 是使DNA链延长的主要聚合酶，目前已知全酶是由7种多肽形成的复合物，含有10种共22个亚基组分（22222222222）和Zn原子。,大肠杆菌DNA聚合酶全酶的结构和功能,延长因子,DNA聚合酶异二聚体,核心酶,校对,引物的结合和识别,促使核心酶二聚化,（1）亚基：具5 3端聚合酶活性（需模板和引物）；（2）亚基具3 5端核酸外切酶的活性。校对作用，以提高保真性；（3）、亚基相连形成核心酶pol，亚基起组建作用；（4）核心酶+亚基后成为二聚体，称为pol；（5）pol与、亚基结合，形成pol，、亚基可增强酶与模板的结合；（6）
8、pol与亚基结合形成全酶，亚基犹如夹子，夹住DNA向前滑动，不脱离，提高持续合成能力。,大肠杆菌三种DNA聚合酶比较,DNA聚合酶,分子量每个细胞的分子统计数5-3 聚合酶作用3-5 核酸外切酶作用5-3 核酸外切酶作用转化率,DNA聚合酶,109，000400+1,120，000100+-0.05,400，00010-20+-50,比较项目,DNA聚合酶III,切除引物修复,修复,复制,功能,1999年发现聚合酶 和，它们涉及DNA的错误倾向修复（errooune repair）,pol不是DNA复制酶，理由：A、该酶合成DNA速度太慢，只是细胞内DNA复制速度的1%；B、持续合成能力较低，
9、而细胞内DNA复制不会频繁中止；C、许多基因突变都会影响DNA复制，但都与pol无关。,3、双链DNA复制的分子机制,（1）冈崎片段和半不连续复制,不连续复制：3 5走向的DNA实际上是由许多5 3 方向合成的DNA片段连接起来的。（已知DNA聚合酶的合成方向都是5 3）,在一个复制叉内两条链的复制方向、合成方式、复制速度是不同的。前导链（leading strand)：以一条链（3 5）为模板时，子代链的合成方向是5 3，合成是连续的，合成速度较快。,后随链(lagging strand):以另一条亲代链（5 3）为模板时，子代链的合成方向不能按照3 5方向进行，因为迄今没有发现这样的DNA
10、聚合酶，因此只能合成方向为5 3方向的许多DNA小片段（约1000-2000dp，7-10S），为1968年日本人冈崎等人发现，叫冈崎片段，然后在DNA连接酶催化下，连接起来形成一条子代链。合成是不连续的，合成速度较慢。当一段新的冈崎片段合成后，pol行使5 3核酸外切酶活性切除引物，再合成一段DNA作为替换，缺口由DAN连接酶封口。,(2)冈崎片段的RNA引物,引物的合成由引物合成酶催化完成，这些酶在模板单链DNA上识别特殊序列，合成RNA引物。它本身没有活性，需要与“引发前体”结合在一起，形成“引发体”后才有活性。引发体在复制叉上移动，识别合成的起始点，引发RNA引物的合成，该过程需ATP
11、提供能量。,方向：以DNA为模板，5 3长度：几个至10个核苷酸，5端含3个磷酸残基，3端为游离羟基。DNA聚合酶III：聚合脱氧核糖核苷酸引物消除和缺口填补：DNA聚合酶IDNA连接酶：将冈崎片段连成长链,为什么需要RNA引物、而且最后要切除？1、DNA聚合酶有校正功能，每引入一个核苷酸都要复查一次，无误后方继续下去，它不能从无到有合成新的链，因为在未核实前一个核苷酸处于正确配对状态时是不会进行聚合反应的；2、RNA引物是从新开始合成的，错配的可能性大，在完成引物功能后即将它删除，而代之以高保真的DNA链。,（3）DNA连接酶 催化子代双链DNA中的切口处的相邻3-OH和5-磷酰基之间形成磷
12、酸二酯键。但不能将两条游离的DNA单链连接起来。同时该酶要求含有3-OH和5-磷酰基的DNA片段能以氢键与互补链结合。DNA3OHP5DNAATP（NAD+）DNA3OP5DNAAMPPPi（NMN）,E,coli连接酶催化下的连接机制,连接酶连接切口,Mg2+,连接酶,A,T,C,G,P,T,T,P,P,P,A,A,C,C,T,G,A,P,A,C,P,P,P,P,OH,T,G,G,A,T,C,G,P,T,T,P,P,P,A,A,C,C,T,G,A,P,A,C,P,P,P,T,G,G,P,缺口,3,3,5,5,5,5,3,3,模板链,模板链,（4）母本DNA双链的分离,解螺旋酶（helicas
13、e）使DNA双螺旋的两条链分开。条件：ATP提供能量，有单链DNA存在。后随链：解旋酶结合于它的模板上，移动方向是5 3前导链：另一种解旋酶叫rep蛋白，移动方向是3 5。,单链结合蛋白（single-strand binding protein，SSB）结合在单链DNA分子上，功能是稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。,拓扑异构酶（DNA松弛酶）（topoisomerase）涉及超螺旋的松弛，复制后又涉及到它们的再次形成。正超螺旋（左）：双螺旋DNA处于拧紧状态时形成的超螺旋，使DNA解开双螺旋困难 负超螺旋（右）：双螺旋DNA处于拧松状态时形成的超螺旋。,拓扑异构酶
14、对DNA的超螺旋进行精确调节，从而在DNA重组修复和DNA其它转变中起作用。分为两类：1、拓扑异构酶：可瞬时打开双螺旋的一条链，然后再连接。不需能量，同转录相关。2、拓扑异构酶；使DNA双链同时断裂，然后再连接。需能量ATP，同复制相关。拓扑异构酶可除去负超螺旋，拓扑异构酶可引入负超螺旋，消除复制前产生的正超螺旋，协同作用控制DNA拓扑结构，有利于DNA解开双螺旋。,参与大肠杆菌染色体DNA复制的主要Pr,DNA旋转酶引入（或松解）DNA解链酶使双螺旋DNA解链单链结合蛋白稳定单链区引物合成酶合成RNA引物DNA聚合酶III全酶合成DNADNA聚合酶I除去引物并填满缺口DNA连接酶连接DNA片
15、段末端,（5）DNA聚合酶的“校对”作用,DNA聚合酶具有三种不同的酶活性。3 5外切酶活性是校对新生DNA链和改正聚合酶活性所造成的“错配”的一种手段。现在所发现的真核生物DNA聚合酶一般没有校正功能。,DNA聚合酶的校对功能,聚合酶,错配碱基,复制方向,正 确核苷酸,5,5,5,3,3,3,切除错配核苷酸,（四）真核细胞DNA复制 不十分清楚，与原核生物DNA复制比较：（一）一致：1、基本机制相似。如半保留复制、半不连续复制。2、所需酶相似。,（二）区别 真核生物 原核生物复制起始点 多个 一个复制方向 双向 单向复制速度 较快 较慢起始点是否连续复制 不 是催化DNA链延长的酶 两种酶（
16、pol、）一种酶（pol）引物酶的结合情况 与DNA聚合酶 与解旋酶,端粒的复制,（1）半保留复制（2）可朝一个方向或两个方向进行复制（3）DNA两条链都从5 3（4）复制是半不连续的，前导链连续，后随链不连续合成（5）合成始于一小段RNA引物（6）复制有多种机制,（五）反转录作用（RNA指导的DNA合成）,指以RNA为模板合成DNA的过程。最先在病毒中发现这种酶，现在发现存在于哺乳动物胚胎和正在分裂的细胞中。,条件1、反转录酶：是一种多功能酶，具以下特性：（1）以RNA为模板合成DNA；（2）水解RNA，具3 5和5 3外切酶活性；（3）以DNA为模板合成DNA。2、前体物质：dNTP3、引
17、物：短链RNA或DNA 适当浓度的Mg2、Mn24、方向：5 3,过程1、以亲代RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链（cDNA），形成RNADNA杂交分子。2、由核糖核酸酶H水解RNADNA杂交分子中的RNA链；3、以刚合成的DNA链为模板合成一条互补的DNA链，形成DNADNA分子；4、DNADNA的去向（1）整合到宿主细胞DNA分子中，但不表达；（2）DNADNA再转录合成RNA，然后翻译成蛋白质，生成子代RNA病毒。,反转录过程中cDNA的合成,突变 基因组DNA的碱基顺序发生突然而永久性的改变。1、点突变：指一个或几个碱基对被置换。有两种形式：转换：一个嘌呤碱基或一个嘧啶碱基转换
18、为另一个嘌呤或嘧啶碱基。如TA被CG替换。颠换：嘌呤碱基变成嘧啶碱基或嘧啶碱基变成嘌呤碱基。如TA被AT替换。2、结构畸变 DNA的大段碱基发生改变。包括：插入、缺失、倒位、易位。,（六）DNA的损伤与修复,DNA突变的类型,野生型基因,碱基对的置换(substitution),移码突变(framesshift mutation),造成DNA损伤的原因可能是生物因素、物理因素或是化学因素；可能来自细胞内部，也可能来自细胞外部；受到破坏的可能是DNA的碱基、糖基或是磷酸二酯键。物理诱变剂：如紫外线、X射线等。生物诱变剂：如噬菌体、抗菌素等。化学诱变剂：直接作用于DNA模板的诱变剂，如亚硝酸、烷化
19、剂等。碱基类似物：如5溴尿嘧啶。移码诱变剂：如普鲁黄。,DNA的损伤修复系统 1、直接修复（direct repair）对由紫外线引起的胸腺嘧啶二聚体的光复活作用是一种高度专一的直接修复方式，只作用于由紫外线引起的胸腺嘧啶二聚体。这种结构不能形成碱基配对，使DNA链丧失了模板的功能。用强的可见光照射受损伤的细胞，可见光将光裂合酶激活，此酶与二聚体结合并将其恢复成两个单独的嘧啶碱。,胸腺嘧啶的形成示意图,DNA紫外线损伤的光裂合酶修复,1、形成嘧啶二聚体,2、光复合酶结合于损伤部位,3、酶被可见光激活,4、修复后酶被释放,2、切除修复（excision repair）是在一系列酶的作用下，将DN
20、A分子中受损伤部分切除掉，并以完整的那一条链为模板，合成出切去的部分，然后使DNA恢复正常结构的过程。包括两个过程：一是由细胞内特异的酶找到DNA的损伤部位，切除含有损伤结构的核酸链；二是修复合成并连接。,DNA的损伤和切除修复,碱基丢失,碱基缺陷或错配,结构缺陷,切开,核酸内切酶,核酸外切酶,切除,DNA聚合酶,DNA连接酶,AP核酸内切酶,核酸外切酶,切开,切除,修复,连接,糖苷酶,插入酶,碱基取代,细胞含有的DNA糖基化酶能使不正确的碱基或发生改变的碱基的糖苷键断裂，切除碱基，产生一个只保留有脱氧核糖磷酸部分的位点。称为AP位点（无嘌呤或无嘧啶的位点）。一旦AP位点形成后，即有AP核酸内切酶在AP位点附近将DNA链切开。在AP位点必须切除若干核苷酸后才能进行修复合成，细胞内没有酶能在AP位点直接将碱基插入，因为DNA合成的前体物质是核苷酸而不是碱基。,
