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1、流式细胞术及其科研应用,流式细胞仪的原理,流式细胞术的基本概念,流式细胞术（Flow Cytometry,简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量,流式细胞术的特点,极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪（Flow cytometer）可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。可同时分析单个细胞的多种特征，当同时用多种分子探针，如用
2、不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色，通过流式细胞分析，即可获得单细胞的多种信息，使细胞亚群的识别、计数更为准确。定性或定量分析细胞：通过荧光染色对单细胞的某些成分如DNA含量、抗原或受体表达量、Ca2+浓度、酶活性以及细胞的功能等均可进行单细胞水平的定性与定量分析 强大的分选功能，在分析的同时可以对特定群体加以分选,流式细胞仪的检测范围,细胞结构细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量,细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性激素结合位点细胞受体,当前流式细胞分析发展趋势,从相对细胞计数到绝对细胞计数 从相对定量到绝对定
3、量分析从单色到多色荧光分析 从细胞膜成分到细胞内成分分析从细胞分析到可溶性成分的流式细胞分析,散射光信号,Right Angle Light Detector Cell ComplexitySSC,Forward Light Detector Cell Surface Area FSC,Incident Light Source,前向角散射光（FSC,Forward Scatter）细胞相对大小及其表面积 侧向角散射光（SSC,Side Scatter）细胞粒度及细胞内相对复杂性,Laser,FALS Sensor,外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）,流式细胞仪的检测信号,荧光信号使
4、用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量,荧光信号,双色直接染色,数据分析,直方图分析,数据分析,点图分析,数据分析,等高图和密度图分析,数据分析,三维图分析,流式细胞仪的应用,临床研究:血液、肿瘤、药理、免疫.生物学研究：遗传、生殖、微生物、细胞生物、毒理、分子生物、.环境研究：海洋生态研究.制药工业食品工业农业畜牧业,流式细胞仪的应用领域,流式细胞仪的临床应用(免疫),淋巴细胞免疫分型淋巴细胞亚群分析CD4绝对计数HIV的诊断与研究淋巴细胞 CD4/CD8分析CD4绝对计数T细胞活化细胞移植的交叉配型和免疫状态监测免疫功能和免疫调控的研究淋巴细胞和单核
5、细胞的活化检测细胞因子的检测HLA-B27检测,流式细胞仪的临床应用(血液),白血病和淋巴瘤免疫分型残留白血病造血干细胞计数PNH诊断网织红细胞分析血小板分析血小板膜糖蛋白分子的表达血小板活化网织血小板分析,流式细胞仪的临床应用(肿瘤),细胞周期分析DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志在L&L病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息DNA非整倍体的交界瘤应按恶性对待形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标多药耐药基因的检测,流式细胞仪的科研应用,树突细胞研究干细胞研究细胞凋亡细胞动力学功能研究环境微生物分析流式细胞术
6、与分子生物学研究,淋巴细胞亚群分析,根据功能，淋巴细胞主要分为B淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关T淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 NK细胞（CD3-CD16+56+），行使免疫监控功能，能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。,淋巴细胞亚群分析,根据CD4、CD8表达，T淋巴细胞又分为T辅助/诱导细胞（CD3+CD4+）T抑制/细胞毒性细胞（CD3+CD8+）Th/Ts 评价那些自身免疫失调或被怀疑是免疫失调或已知患有免疫缺陷的病人的免疫状态，此外，这一比值还可用来监测骨髓移植病人以免受到急性GVHD的攻击 Th/Ts升
7、高：自身免疫性疾病（类风湿性关节炎、SLE）Th/Ts降低：病毒感染、恶性肿瘤、再生障碍性贫血,常见疾病的T 淋巴细胞的变化：,疾病 CD4+CD8+CD4+/CD8+类风湿性关节炎（活动期）系统性红斑狼疮-或（活动期）多发性硬化症 重症肌无力 膜型肾小球肾炎 胰岛素依赖性糖尿病 乙型肝炎 自身溶血性贫血 上呼吸道感染,常见疾病的T 淋巴细胞的变化,CD3+CD4+CD8+CD4+/CD8+肿瘤 再障及粒细胞减少症 巨细胞病毒感染 血小板减少 活动性特应性皮炎 过敏性皮炎,淋巴细胞亚群双色分析,12%,76%,49%,26%,11%,AIDS 病人T亚群分析,27-51%,15-44%,50-
8、84%,先天性无 r 球蛋白血症,5-18%,淋巴细胞活化功能研究,T淋巴细胞活化,细胞数目增殖细胞表面表达活化标记分泌细胞因子,T细胞激活抗原表达的动力学曲线,活化的淋巴细胞分泌细胞因子,FastImmune Assay System快速全面检测淋巴细胞功能,BD FastImmune Activation System快速免疫活化检测系统,BD FastImmune Activation System快速免疫活化检测系统,应用实例：HIV病例T细胞活化检测,BD FastImmune Cytokine System快速免疫细胞因子检测系统,Activation 37 Incubation,
9、Intracellular Stain,Lyse/Fix,Acqusition,Permeabilize,lymphocyte,erythrocyte,stimulus,Surface Stain,Wash,cytokine,Wash,Wash,protein blocking,基于细胞水平的研究胞内因子胞外因子,BD FastImmune Cytokine System快速免疫细胞因子检测系统,应用实例：分析1型与2型免疫反应,Cytometric Beads Array(CBA)流式液相多重蛋白定量技术,导言,常规的蛋白分析方法：ELISA：一次反应只能检测一个指标Western blot
10、：不能对蛋白精确定量不足之处：检测多个指标需耗费大量样本分批操作导致组间差异大操作繁琐，耗时耗力如何能够从单个微量样本中一次检测多个目标蛋白，并加以定量，获得高精确度的数据呢？针对于此，BD-Pharmingen成功研发了基于流式细胞仪检测平台的液相多重蛋白定量技术BD Cytometric Bead Array，简称CBA,CBA技术简介,CBA是一系列带有不同强度红色荧光、包被有捕获抗体的微球，类似ELISA的捕获孔板，可以捕获液相样本（血清、血浆或者细胞培养上清液等）中相应的抗原，再结合PE标记检测抗体，形成双抗体夹心结构，通过流式细胞仪进行荧光检测，便可同时对样本中的多种可溶性蛋白成分
11、进行定量,+,+,Analyte of interest,Fluorescent detection Ab,capture Bead,capture Ab,Bead,BD Cytometric Bead Array,1,2,3,不同强度红色荧光的捕获微球，在FCM FL3检测,不同的目标蛋白,PE 标记的检测抗体，在FCM FL2检测。PE的荧光强度即反映靶蛋白的含量,4,5,6,Human Th1/Th2 Lymphokine CBA,Human Th1/Th2 Lymphokine CBA,Th1/Th2 panel:IL2,IL4,IL5,IL10,TNF,IFN用 FL3荧光的强度不同
12、区别 种不同的微球（beads）Direct sandwich immunoassayFL2(PE)detector reagent样本处理6 cytokines from a 50 L sampleThree pipetting steps3 hour total incubationQuantitative results and complete report generationSoftware assisted quantitative analysis,with curve fitting algorithmResult reporting included in software
13、,Human Th1/Th2 Lymphokine CBA,Human Th1/Th2 Cytokine CBA Kit,No sample added inDetector antibodies only,Chemokine-I CBA Assay Standard,0 pg/ml,CBA Assay Standard,10 pg/ml,CBA Assay Standard cont.,Chemokine-I CBA Assay Standard,20 pg/ml,CBA Assay Standard cont.,Chemokine-I CBA Assay Standard,40 pg/ml
14、,CBA Assay Standard cont.,Chemokine-I CBA Assay Standard,80 pg/ml,CBA Assay Standard cont.,Chemokine-I CBA Assay Standard,156 pg/ml,CBA Assay Standard cont.,Chemokine-I CBA Assay Standard,312 pg/ml,CBA Assay Standard cont.,Chemokine-I CBA Assay Standard,625 pg/ml,CBA Assay Standard cont.,Chemokine-I
15、 CBA Assay Standard,1250 pg/ml,CBA Assay Standard cont.,Chemokine-I CBA Assay Standard,2500 pg/ml,CBA Assay Standard cont.,Chemokine-I CBA Assay Standard,Human Th1/Th2 Lymphokine CBA 标准曲线,5000 pg/ml,2500 pg/ml,1250 pg/ml,625 pg/ml,312 pg/ml,80 pg/ml,20 pg/ml,IL-2IL-4IL-5IL-10TNF-IFN-,IL-2IL-4IL-5IL-
16、10TNF-IFN-,操作步骤,检测物与捕获微球共孵育。洗涤。标记荧光探测试剂（FITC或PE标记）。洗涤。流式细胞仪上机检测。CBA分析软件批量数据分析。,CBA 分析软件,Home Screen,Toolbar,Calibration entry screen,与传统的ELISAs检测相比,能够同时对单一样本进行多种目的蛋白检测较传统检测节省样本量（50l）与ELISAs相比灵敏度高（2.8pg/ml）、重复性好检测的线性范围宽（0-5000pg/ml）所有分析只需一组标准曲线避免酶联反应所致人工假象强大的CBA分析软件节省操作时间、检测时间和分析时间,Human Allergy Medi
17、ator Kit,使用Prostate-specific antigen（PSA-3）及其突变体PSA-3A对前列腺癌患者T细胞免疫，通过Human Th1/Th2 Cytokine CBA Kit检测免疫T细胞的细胞因子分泌水平A，B，C为稀释标准，D为无处理对照组，E为PSA-3A处理组，F为PSA-3处理组摘自Terasawa H,et al.Clinical Cancer Research.Vol.8,41-53,January 2002上述研究发现PSA-3A比PSA-3能更有效的杀伤前列腺肿瘤，与PSA-3A能刺激T细胞分泌更高水平的IL-2、IL-4、IL-5和IFN-有关，为后
18、续药物开发打下基础,CBA新产品系列CBA Flex Set,基本原理与CBA Kit相似，略有不同检测原理：Flex Set微球带有近红外和红色两种荧光，分别在流式细胞仪的FL3（近红外荧光）和FL4（红色荧光）通道检测，通过这个二维矩阵（对应于微球上的特定序号）识别捕获微球，从而鉴定目的蛋白，PE标记的检测抗体在FL2通道来对目的蛋白定量,new,CBA Flex Set的分析软件 FCAP Array Software,CBA Kit与CBA Flex Set,CBA Kit同时检测5、6或者7个全部试剂CBA Analysis Software检测指标组合固定,CBA Flex Set
19、最多达75个需另购Buffer kitFCAP Array Software检测指标可自由组合,CBA/CBA Flex set的应用领域,血清、血浆、眼泪、房水、唾液、体腔灌洗液、细胞培养液上清、细胞裂解物等各种液相样本中可溶性细胞因子、炎症因子、趋化因子、酶等的浓度检测细胞信号传导中磷酸化蛋白、凋亡相关蛋白定量分析 免疫疾病或传染疾病（如眼部疾病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、新生儿溶血症及脓血症、病毒性感染等）的辅助诊断和监控肿瘤研究药效评价，药物研发、疫苗研究总体免疫功能分析,现有CBA Kit产品,现有CBA Flex Set产品,树突状细胞（Dendritic Cell，DC）,
20、DC的分化和成熟,DC可分为前体DC，未成熟DC，成熟DCDC起源于骨髓CD34+多能细胞，在GM-CSF作用下，进一步分化为DC前体细胞，包括髓系前体和淋巴系前体，并离开骨髓进入外周血。在外周血中至少有两种DC前体被鉴定出来：Plasmacytoid DCPDC浆细胞样的树突细胞 Myeloid DCMDC髓样的树突细胞血液中的前体DC随血液迁移到皮肤、胃肠道、心、肝、肺等非淋巴器官发育为未成熟DC未成熟DC摄取外来抗原后，可自发成熟，由外周向次级淋巴器官归巢在成熟过程中，DC摄取和加工处理外来抗原的能力逐渐减弱，而递呈抗原的功能逐渐增强,A review of Jacques Banche
21、reau,树突状细胞的可塑性,DC在不同细胞因子和生长因子的作用下可以向着不同的方向分化 DC分化过程中的不同刺激引导它们向多种组织和器官移动，在这些组织中担当起对抗入侵感染因素的哨兵,DC的表面标志,人DC的主要特征性表面标志为CD1a和CD83，CD83还是DC充分成熟的标志。成熟DC高表达CD80（B7-1），CD86，CD40和CD54等共刺激分子，而未成熟DC不表达或低表达这些分子未成熟DC具有强大的内吞作用，并高表达大多数趋化因子受体所有DC共同的突出特点是能高水平表达MHC-II类分子如HLA-DR，DC成熟过程突出的标志是MHC-II类分子的重分布，从主要在细胞浆内转变为主要在
22、细胞膜表面。,人外周血DC亚群的鉴定,PDC：linnegCD11cnegCD123high；MDC：linnegCD11chighCD123low 二者还都高表达MHC-（HLA-DR），但都不表达lin（CD3，CD14，CD16，CD19，CD20，CD56）,注：CD11c：整合素x链 CD123：IL-3受体链,DC体外诱导分化,监控DC成熟度,BD Multicolor MDDC phenotyping reagentCD209(DC-SIGN)：DC独有标志CD83：充分成熟标志CD86：DC成熟过程中表达增加,小鼠DC,小鼠DC的标志是CD11c，成熟DC也有MHC-和CD80
23、，CD86的表达小鼠DC前体主要分为两类：功能上等同于人MDC和PDC小鼠DC制备：小鼠骨髓BD IMag Mouse Dendritic Cell Enrichment Set大鼠DC：常用标志OX62，OX6（MHC-），CD80，CD86等,细胞凋亡检测,细胞凋亡的分析,细胞凋亡与细胞坏死是两个不同的过程细胞凋亡的主要检查手段形态学检查DNA Ladders实验流式细胞仪检查与凋亡相关的病理过程HIV自身免疫性疾病肿瘤,细胞凋亡的分析,细胞凋亡的主要表现细胞内水解酶改变：如Caspase-3活化细胞膜不对称性改变，磷脂酰丝氨酸外翻，但仍然保持膜的完整性：Annexin V/PI细胞核DN
24、A的断裂改变：TUNNEL实验（APO-BRDU，APO-DIRECT）凋亡相关蛋白：FasBcl-2,细胞凋亡PI分析,PI-Fluorescence,#Events,凋亡细胞,正常G0/G1期细胞,细胞凋亡Active Caspases-3,细胞凋亡Caspases-3,细胞凋亡Annexin,细胞凋亡Annexin,凋亡检测（Annexin V/PI法）,凋亡检测（BrdU法）,细胞凋亡BrdU,流式分选 与分子生物学研究,流式分选与分子生物学研究,除了将分选得到的细胞进行后续培养研究外，FCM分选系统可为PCR、FISH等分子技术提供纯度较高的特异性细胞群，减少研究中的干扰因素，获得更
25、准确的实验结果。,流式与分子生物学-FISH,以流式细胞仪分选目的细胞分选后的细胞进行FISH右图显示未分选前混合细胞较小的PBMCs显示有两个红色斑点(X探针)，较大的Daudi细胞显示有一个红色斑点及一个绿色斑点。,分选后的细胞进行FISH,分选后细胞进行PCR分析,流式&干细胞研究,SP细胞,为什么要研究干细胞,干细胞替代治疗治疗血液疾病的骨髓移植、脐带血移植比较成熟应用骨髓干细胞移植治疗心肌梗死和血管性疾病 骨髓间充质干细胞等对神经系统疾病、糖尿病的治疗作用已在动物模型中取得一定进展药物筛选利用干细胞的分化潜能体外构建各种组织模型，通过基因修饰等手段研究药物作用靶点，毒理、药理等发育生
26、物学基础理论研究通过gain-of-function和loss-of-function研究基因在分化、发育中的功能借助体细胞核转移技术建立各种疾病的干细胞模型研究疾病成因及治疗途径,SP细胞的鉴定和分离,大部分SP细胞保持原始细胞的c-kitSca-1Lin表型。Nakauchi等研究认为，CD34low/c-kitSca-1Lin细胞和SP细胞有一个很大的交叉，而长期的骨髓造血活性只发现在CD34low/c-kitSca-1Lin的细胞。SP细胞群缺乏明确的Marker，利用流式细胞仪检测其对活细胞染料Hoechst 33342的染色排斥是目前最准确和推荐的鉴定方法，用该染料活染SP细胞时，
27、经紫外激发表现为Hoechst 33342双波长荧光阴性或弱阳性的细胞群体，能与非SP细胞区分。,Hoechst染色的C57Bl/6小鼠的全骨髓细胞,Hoechst单染,Hoechst/PI双染,流式鉴定小鼠骨髓和CD34富集的人脐血中的SP细胞,摘自Flow Cytometry Protocols（第二版）,Hoechst 33342染色的小鼠骨髓中SP表型和HSCs表面抗原表达的关系,右图显示的是KLS(c-KitLinSca-1)细胞，可见KLS细胞在SP区域内高度富集,摘自Flow Cytometry Protocols（第二版）,流式细胞仪的其它应用,酶活力的测定,动力学研究-钙离子检测,流式网络资源,关键词搜索：FCM，FACS，流式（中文）,谢谢！,
