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1、生态毒理学研究方法,其中一类研究方法：从复杂系统中发现某些环境要素，研究在此环境要素条件下，污染物的行为(模拟分析)；利用自然生态系研究污染物的变化；详细分析环境中的样品，确定污染物定量方法。,毒性的影响因素,生物因素(1)生物分类组别(taxonomic group)种属和个体差异：不同种属的生物或同一种属不同个体之间对同一毒物的反应差异，原因复杂，但主体原因是毒物在体内代谢差异(包括代谢酶)所致。在进行毒性实验时，应尽可能选择条件一致的生物以减少个体差异造成的影响。(2)年龄阶段/机体大小反应灵敏度差异。新生和幼年生物通常对毒物较成年生物敏感。新生生物中枢神经系统发育不完全，对有关的兴奋剂
2、敏感性差，而对抑制剂则较为灵敏。新生生物的膜通透性较强，对某些脂溶性神经毒物的毒性反应较大。经代谢转化后毒性增强的化学物，对新生和幼年生物毒性较成年低，反之，在体内可迅速代谢失活的化学物，对新生和幼年生物毒性可能较大。(3)营养与健康营养不足或失调影响化学物毒性作用。如蛋白质缺乏引起酶蛋白合成减少、活性降低，解毒能力降低，毒性增加。维生素缺乏也有类似情况。健康状况也有影响。(4)生物节律即生物钟，化学物的毒性与其进入体内发挥作用的时间有关。,非生物因素(1)温度(每增加10C，多数有毒物的毒性会变化2到4倍)影响方式复杂。适应温度和实验温度。,毒性的影响因素,适应温度,耐受温度,抑制水平(产卵
3、),负载水平(活动生长),致死阈值 5%,致死阈值 50%,最终初始致死温度,三种毒性终点(死亡、生长、产卵)下的适应温度和耐受温度的关系。虚线各自内部面积指示耐受区。,毒性的影响因素,(2)pH和碱度pH对毒性的影响是多方面的，在酸性条件下(pH5)时，H+自身对水生生物便是致命的。酸对鱼生理影响的集成模型如下图所示：,2H+Ca3(PO4)2 3Ca2+2HPO422H+CaCO3 Ca2+CO2+H2O,H+,CO2+H2O,K+,Na+HPr,H+,+Na+Pr,H+,H+,鳃,ECF,H+NH4,Na,H+,H+HP42H+NH3,Ca2+,肾,骨骼,ICF,H+HCO3,K+HPr
4、,H+K+Pr,K+,HP42+,NH3,H+,NH4H2PO4,ECF:外细胞液ICF:内细胞液Pr:蛋白质,H+还能影响痕量金属的毒性，方式为：(1)影响水中的金属形态；(2)与金属竞争生物膜上的表面反应位。下图为天然水中痕量金属的主要形态及其转化。,毒性的影响因素,按操作定义的金属形态,样品,原始样品在室温下风干，然后在105C的烘箱中烘干。用玛瑙研钵研磨后，过尼龙筛，筛选一定孔径的颗粒。取一定量样品，按下述方法对金属进行化学逐级提取：,蒸馏水(W/V1:20,2h,25C),液相：水可溶态,固相,1M/0.5M MgCl2(pH=7,W/V=1:20,2h,25C),固相,液相：离子交
5、换态,1M NaOAc(pH=5.1,W/V=1:20,2h,25C),固相,固相,固相,液相：碳酸盐结合态,液相：中等可还原态,液相：有机硫化物结合态,0.04M NH2OHHCl(在25%HOAc中,W/V=1:20,2h,96C),液相：残渣态,30%H2O2+0.02M HNO3(pH=2,W/V=1:20,4h,85C),浓HNO3HClO4HF(8h,160C),HendersonHasselbach方程式,对于弱酸HA H+AKa=(H+)(A)/(HA)logKa=log(H+)(A)/(HA)logKa=log(H+)+log(A)/(HA)log(H+)=logKa+log
6、(A)/(HA)pH=pKa+log(A)/(HA),对于弱碱HB+H+BKa=(H+)(B)/(HB+)logKa=log(H+)(B)/(HB+)logKa=log(H+)+log(B+)/(HB+)log(H+)=logKa+log(B+)/(HB+)pH=pKa+log(B)/(HB+),解离常数pKa与弱酸和弱碱pH的关系污染物处于pH变化的水介质中，其吸收进入机体内在相当程度上受pH影响，即在肠胃消化道内的酸碱反应。,由上述关系，pH影响弱酸和弱碱的水溶解度。此外，pH还能影响亲脂金属形态的生物有效性，不经形成表面络合物而穿过细胞膜。,(3)盐度主要应用于盐度变化明显得海湾地区。对
7、大多数金属而言，低盐度会增加毒性。盐度对金属生物有效性的影响主要与其形态有关。(4)硬度硬度的主要成份是二价钙离子和镁离子。美国环保局USEPA定义硬度通常以CaCO3等价值。(5)化学混合物(isobologram，等热辐射测量图)一般地，同一化学分类的化学物具有相似的毒性。混合物毒性并非是简单加和关系。,毒性的影响因素,化学物B,LC50,化学物A,LC50,直接化学物相加,协同/增强,无相互作用,无相互作用,联合毒性行为(中间加和响应),拮抗作用,有毒混合物模型：条目定义化学物A：96小时LC501mg/L化学物B：96小时LC50=10mg/L两者分别按1mg/L和10mg/L加入,9
8、6小时死亡描述,定义,50%死亡,50%死亡,50%死亡(1)倍数比例增加(2)低于情形(1)(3)高于情形(1),无相互作用，各自反应,拮抗作用，混合低于各自,相加,直接相加,低于加和,增强作用,(6)溶解有机碳(DOC)溶解有机分子，分子量跨度从低于1000高至100000以上。作为金属离子的络合剂。(7)脂水分配系数(化合物的毒性除与其在脂水相的相对溶解度有关，还与其体液绝对溶解度有关)(8)电离度(弱酸或弱碱型有机物在体内pH条件下，电离度低，非离子行比例高，容易被吸收发挥毒性)(9)挥发度和蒸气压(暴露接触的机率)(10)分散度(粉尘、烟雾等固态物质毒性与分散度即颗粒粒径大小有关)(
9、11)纯度(杂质：剩余原料、合成副产品、添加剂、赋形剂)(12)湿度(伴随高温时，化学物经皮肤吸收速率加快)(13)气压颗粒物的作用：食物的重要性气态污染物除去呼吸吸入和气孔/表皮进入植物外，还有两条基本进入途径：以溶解态形式直接通过生物膜传输；摄取污染颗粒物质(仅对异养生物)。有机污染物孔隙水相和沉积物相之间分配：Cw/Cs=Kocfoc，Koc，foc分别为有机相分配系数和沉积物有机碳分数。沉积物水，土壤水分配系数可以由辛醇水分配系数近似：logKoc=a Kow+b。,毒性的影响因素,沉积环境中影响化学物生物有效性的许多重要过程受沉积物氧化还原条件影响。其中，常处于厌氧环境的沉积物中硫化
10、物对金属的作用很大。酸可挥发性硫化物(acid volatile sulfide,AVS)与酸化过程中同步提取金属含量的关系是重要的描述沉积物中金属生物有效性的指标。比率形式：AVS/SEM1；差减形式：AVSSEM。但具体情况尚需具体分析，可能有其它因素控制毒性发挥作用。同时，AVS方法比较依赖沉积物孔隙水作为控制金属生物有效性的因子，没有考虑底栖生物的摄食习惯和行为，如摄取颗粒物。定量结构与活性的关系(quantitative structure activity relationship,QSAR)有助于通过比较预测新化合物的生物活性、作用机理和安全限量范围。目前正处于发展阶段。QSAR
11、，QSBR(biodegradation)，QSPR(Properties)。前提假设：某一化合物的子结构均会对整体性质作出贡献，类似的化合物应对靶标具有相似的作用模式。现阶段通常采用简单或多元回归方程式：Y=a+bX；Y=a+b1X1+b2X2+bjXj有关的因素：(1)同系物的碳原子数；(2)烃基：分子结构引入烃基，脂溶性增加，易于通过细胞膜，毒性增强，但烃基结构可增加毒物分子的空间位置阻碍效应，从而使毒性降低。(3)分子饱和度：分子中不饱和键增加是化学物活性增加，毒性加强。,毒性的影响因素,(4)卤素取代：卤族元素通常有较强的吸引电子能力，引入卤素原子使电负性增加，易于与酶系统结合，毒性
12、增强。(5)羟基：引入羟基分子极性增强，毒性增加，如苯中引入羟基变为苯酚。(6)酸基和酯基：酸基(羧基和磺酸基)引入使水溶性和电离性增加，脂溶性降低，难以转运和吸收，毒性降低。但酸基经酯化后，效果相反。(7)胺基：胺具碱性，易于蛋白和核酸的酸性基团、酶反应。(8)构型(同分异构体；旋光异构体)：一般对位邻位间位，但也有例外。由于受体和或酶一般只能与一种旋光异构体结合，产生生物效应，化学旋光异构体之间的毒性不同。(9)有机磷化合物：主要指五价磷有机杀虫剂。接触条件(1)接触途径：接触途径不同，则吸收、分布不同，其代谢转化、毒性反应的性质和程度也不同。(2)溶剂和助溶剂：不同溶剂和助溶剂可加速或减
13、缓毒物吸收、排泄，从而影响其毒性。(3)毒物浓度和容积：稀释作用情况不一致，有的浓溶液毒性强，有的则稀释后反而强。(4)交叉接触：不同暴露途径交叉作用。,毒性的影响因素,情形A,情形B,情形C,生态毒理学应包含各种组织水平上的研究,不同类型生物组织水平之间的关系,“嵌套形式”，细胞效应即简单地意味着所有生物水平的效应。,情形B和C中的竖条纹区域代表不确定性(Uncertainty)。,低级生物响应(如酶活性或免疫响应的改变)可能代表从健康反应直至压迫(stress)的广谱范围。因此，难以确定这种响应和有机体适应性的定量关系。从个体水平响应结果外推至种群或群落水平属于另一类问题(如情形C)。,生
14、态毒理学方法学方法,生态毒理学研究的特点(1)研究目标：保护多物种的种群和群落免受造成现实或潜在危害有毒物浓度的暴露。(2)关注物种：受控于直接实验法的需要。(3)鉴定不穷尽性：无法鉴别所有关心的受试物种。因此，结果外推程度不确定。有机体在生态系统中的反应与实验室内受控条件下的结果可能不一致。(4)受试有机体：尤其指水生生物，生活在多变的环境中，体温随环境温度改变，有些与温度有关的毒性预测性较差。外部或暴露剂量及暴露时间直接从测定结果获得。(5)毒性作用机理和结构活性关系：偏重于基础研究，重点在于测定效应和临界(阈值)浓度。(6)常用检测方法：通常较新，有些已标准化，但对于生态系统层次的有效性
15、尚未确定。在介绍、讨论和评价各种方法的理论和实践意义时，经常涉及生物指示物、标记物，生态指示物和模型。,生物指示物的一般概念和原理生物指示物可被视为了解一种条件和状态的手段。利用生物指示物所依托的一般原理在于有机体对生态环境特定条件或特定条件变化的产生响应，而且生物响应可加以测定。生态指示物是指示生态系统条件/状态的生物响应，但不一定是生态系统水平上的一种测度。例如湖水中叶绿素a浓度是仲夏浮游植物群落的一种生物测度，并用于有关磷浓度的湖泊生态系统整体状态的指示物。高浓度磷会导致富营养化，引起湖泊中多种营养水平的响应。评价富营养化程度，尽管可选用磷浓度或一些鱼的种群和群落参数，但对于常规评价，叶
16、绿素a测定是可靠且相对简单的指示物。理想的生物指示物条件：生物响应可以定量化；专用于扰动；在实验室和现实环境中均可进行观察；对系统整体功能有重复性和可靠性。区分两种生物响应：(1)达到某一实验终点；(2)某一化学物质在组织中积累。生物指示物和生物监视器的定义：推荐将生物指示物用于所有类型的响应，从亚细胞至系统，而不是物质累积。而生物监视器则主要针对机体累积类型。两者的性质比较(参见下述表格),生物指示物和生物监视器性质比较,对潜在有毒物的耐受性和抵抗性(I)耐受性：指一种经受暴露于非正常高浓度物质(元素或化合物)的能力，这些物质能导致负面生物效应且能不确定地加以维持。最常提及的例子出现在物种的
17、内部，给定物种的生态类型或种系表现出一种经受给定污染物浓度的能力，该浓度对原始种系明确有害。(II)耐受机理a.阻止有毒物的吸收；b.吸收然后将污染物存放于与机体相隔离的结构中(如结石，特殊的包裹物和液泡)或者以非生物活性形式存放；c.内部或外部降解化学物成为较少危害的物质；d.吸收然后通过细胞的排泄而排除；e.回避(仅对可运动的生物)。,生物尺度问题(1)生化标记物/指示物的原理和性质生化指示物的特征：(i)在较大的有机体范围内能观察到特定的生化响应；(ii)响应专用于特定污染物或污染物族；(iii)实验室结果应与野外响应有关；(iv)生化响应与功能降低或削弱相关或有关联。对于第(iv)点存
18、在争议：观察到的生化和生理参数体现病理学条件的程度，病理学条件调和有机体整体适应性。现有几种方法以澄清这种理解上的争议：(a)野外采集物种的生化标记物已经与暴露于实验室条件下特定化学物或化学物组；(b)沿污染梯度的不同样点测定采集的生化标记物；(c)证据权重策略得到不同生化标记物相关性的支持。(2)常用的生化标记物组酶；单(加)氧酶(混合功能氧化物酶)；阶段II结合酶(glutathione谷胱甘肽转运酶)；DNA损伤和修复生物标记物；金属巯基组氨酸三甲基内盐；受迫蛋白；免疫功能；组织病理学；生长域范围(scope)。,常用生化标记物的样例,常用生化标记物的样例(续),(3)独立物种作为指示物
19、(参见表格)或监视器(参见表格)；(4)生态系统指示物的替代物至少须满足三个基准条件用以限定物种作为替代物种：a.必须是其所参与食物网的强大的累积者；b.必须是所在系统中数量丰富且分布广泛；c.必须是易于识别且生态相关。可指示环境压迫的群落水平响应：a.生物体平均大小降低；b.生物量降低(biomass)；c.特有种被普通种代替；d.物种丰度降低(物种数目)；e.群落组成改变(相对丰度)；f.某些物种生殖损害；g.食物网结构和长度改变；h.捕食者数目减少，被捕食者数目增加。,陆生指示物种的样例,水生指示物种的样例,用于环境监测的陆生物种样例,用于环境监测的陆生物种样例(续),用于环境监测的水生
20、物种样例,生态毒理学方法学方法,群落和更高层次的指示物：毒理学中的生态方法(1)有毒物质的物种间效应(2)受有毒物影响的营养水平/层次之间的相互作用(3)种群和群落响应终点模型(1)概念(2)质量平衡模型两个原则，涉及的过程(平衡分配，降解反应，传输过程)；环境介质特性：大气，气溶胶，水，悬浮沉积物，水生生物，底泥，土壤，陆生生物；分解过程和逸度；稳态质量平衡模型；鱼的化学物吸收/去除模式；效应模型化(QSAR)。,(3)其它应用生态毒理学的模型(4)生态毒理学模型的优势、局限性和缺陷群落或更高层次响应研究方法的样例(1)围栏(enclosure)：微观世界(microcosms)和中观世界(mesocosms)的优势与局限性；(2)整体系统的处理；方法学中技术的进步对生态毒理学的影响(1)分析化学；(2)电子显微镜；(3)计算机；方法的选择(1)生物尺度选择；(2)方法选择；(3)受试有机体或系统的选择；(4)可用的资源个案实例,生态毒理学方法学方法,
