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1、生物分离（工程）技术,主讲：吴元喜E-mail:联系电话：2010年8月,生物工业下游技术一般工艺过程,第六章沉淀分离技术,一、蛋白质的表面特性 二、盐析沉淀 三、有机溶剂沉淀 四、热 沉 淀 五、其他沉淀法 六、思考题,沉淀的含义,沉淀结晶：是物理环境的变化引起溶质的溶解度降低、生成固体凝聚物的现象。沉淀是不定形的固体颗粒，构成成分复杂，除含有目标分子外，还夹杂共存的杂质、盐和溶剂，其纯度远低于结晶。沉淀法是采取适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液中各种成分的溶解度，使溶液中的欲提取目标物和杂质分开的技术，所以也称溶解度法。沉淀法是一种初级分离技术,也是一种浓缩技术。多步沉淀操作也可制备高
2、纯度的目标产品。,怎样使目标物和杂质分开？,第一种做法是采用使目标物的溶解度最大，而杂质溶解度尽可能小的条件，即需要的目标物保留在溶液中，杂质则被沉淀。第二种做法是选择使目标物选择性地沉淀出来，杂质保留在溶液中。一般认为，在第一种情况中，应使要提取目标物的溶解度大于10gL；第二种情况，要目标物的溶解度应控制在O.1O.01gL。,沉淀分离技术的原理和方法,一、蛋白质的表面特性 二、盐析沉淀 三、有机溶剂沉淀 四、热 沉 淀 五、其他沉淀法 六、思考题,一、蛋白质表面特性,蛋白质表面结构特点蛋白质的胶体特性,蛋白质表面结构特点图,蛋白质的胶体特性,蛋白质的相对分子质量(6kD-1000kD，直
3、径约l-30nm)分子表面的水化层 紧密结合的水化层可达到0.35gg蛋白质，疏松结合的水化层可达到蛋白质分子质量的2倍以上分子间的静电排斥（双电层）蛋白质沉淀的机制（环境、沉淀剂）,蛋白质分子双电层示意图,1、双电层中存在距表面由高到低(绝对值)的电位分布，双电层的性质与该电位分布密切相关。2、紧密层和分散层交界处的电位值称为(zeta)电位，带电粒子间的静电相互作用取决于电位(绝对值)的大小。3、当双电层的电位足够大时，静电排斥作用抵御分子间的相互吸引作用(分子间力)，使蛋白质溶液处于稳定状态。,二、盐析沉淀及其应用,1、盐析沉淀的原理2、影响盐析的因素3、盐析的操作4、盐析操作必须注意的
4、问题5、应用,1、蛋白质盐析沉淀的原理,蛋白质沉淀的机制图溶解度与离子强度的关系KS分段盐析和分段盐析几种常用盐对某些蛋白质的盐析常数,蛋白质沉淀的机制图,蛋白质溶解度与离子强度的关系,蛋白质溶解度与离子强度的关系,logS/S0=-KSI logS logS0-KSI=-KsI logS KsI S、S0-在离子强度为I和0时的溶解度（g/dm3）；-常数（与蛋白质的性质相关）；Ks-盐析常数（与盐的性质相关）；I离子强度，moldm3。（I CiZi2）举例：,蛋白质溶解度与离子强度的关系,KS分段盐析和分段盐析,logS logS0-KSI=-KsI KS分段盐析：温度和pH一定（），改
5、变 I和盐；分段盐析：盐和I一定（KS I），改变温度和pH,几种常用盐对某些蛋白质的盐析常数,2、影响盐析的因素,无机盐的种类及选择温度pH值,无机盐的种类及选择,Ks 取决于盐的性质，与离子价数成正比，与离子半径和溶液介电常数成反比。常见阴离子的盐析作用顺序：PO43-SO42-CHCOO-Cl-N03-Cl04-I-SCN-阳离子的盐析作用顺序为 NH4+K+Na+Mg2+盐类必须溶解度大、受温度影响小，而且盐溶液密度不高。,一氧化碳血红蛋白在不同电解质下的溶解曲线,常用盐析剂在水中的溶解度（g/100ml）,温度和pH值,在高离子强度溶液中，温度升高，蛋白质的溶解度下降;在低离子强度溶
6、液或纯水中，蛋白质的溶解度随温度升高而增大;在pH接近蛋白质等电点的溶液中蛋白质的溶解度最小(值最小).,温度对盐析的影响,pH对盐析的影响,3、盐析的操作,(NH4)2SO4浓度的计算与调整盐析曲线的制作分步盐析法,(NH4)2SO4浓度的计算与调整,饱和度的意义饱和溶液调整的计算固体直接加入的计算查表法,饱和度的意义,饱和(NH4)2SO4溶液的配制:水+过量(NH4)2SO4,加热10min(50-60),过滤,静置2h(0 或10),析出结晶后为100%饱和度。在25时，溶解度为767gL 在0时，溶解度为697gL溶液饱和度：=饱和(NH4)2SO4溶液的体积/溶液总体积,饱和溶液调
7、整的计算,V:需要加入饱和硫酸铵溶液的体积V0:原溶液的体积S1,S2:分别为原溶液和所需达到的硫 酸铵饱和度,固体直接加入的计算,W：将一升S1提高到S2时需加入的硫酸铵克数G和A为常数，0时，G=707，A=0.27 25时，G=756，A=0.29,查表法,盐析曲线的制作(设操作温度为0),(1)将料液分成等体积的数份；(2)计算达到10-100饱和度所需加入的硫酸铵量，并在搅拌下分别加到料液中，搅拌1h，静置1h以上；(3)离心（3000rpm）40min后，将沉淀溶于缓冲溶液中，测定其中总蛋白和目标蛋白的浓度；(4)分别测上清液中总蛋白和目标蛋白的浓度，比较沉淀前后蛋白质是否保持物料
8、守恒，检验结果的可信度；(5)以饱和度为横坐标，上清液中总蛋白和目标蛋白浓度为纵坐标作图。,盐析曲线图,分步盐析法,4、盐析操作必须注意的问题,中性盐的纯度要高、溶解要充分；盐析常与等电点沉淀相结合；选择适当的沉淀温度；选择适当的蛋白质浓度；饱和硫酸铵要现配现用；盐析产品需脱盐后进一步纯化。,等电点沉淀,三、有机溶剂沉淀,1、有机溶剂沉淀的机理2、有机溶剂的选择与用量3、温度和pH对有机溶剂沉淀的影响4、有机溶剂沉淀时应注意的问题,1、有机溶剂沉淀的机理,降低溶液的介电常数，如：20时，水的介电常数为80，82%的乙醇的介电常数为40。破坏蛋白质胶体分子的水化膜，破坏蛋白质分子的次级键，使疏水
9、基团暴露，形成疏水层。,2、有机溶剂的选择与用量,丙酮乙醇甲醇乙醇的稀释有机溶剂用量的计算有机溶剂沉淀曲线,乙醇的稀释,有机溶剂用量的计算,V=V0(S2-S1)/(100-S2)V需加入有机溶剂的体积；V0蛋白溶液的原始体积；Sl蛋白溶液中有机溶剂的浓度；S2蛋白溶液中欲达到的有机溶剂浓度。,3、温度和pH对有机溶剂沉淀的影响,4、有机溶剂沉淀时应注意的问题,低温下操作中性盐的盐溶作用可减少变性 多价阳离子可降低蛋白质的溶解度 防止过量有机溶剂引起共沉淀沉淀应尽快分离，并溶于缓冲液中,四、热 沉 淀,根据蛋白质间的热稳定性的差别进行蛋白质的热沉淀，分离纯化热稳定性高的目标产物。热沉淀是一种变
10、性分离法，带有一定的冒险性，使用时需对目标产物和共存杂蛋白的热稳定性有充分的了解。,五、其他沉淀法,非离子型聚合物聚乙二醇(PEG)是蛋白质稳定剂，也可促进蛋白质的沉淀。聚电解质有酸性多糖和羧甲基纤维素、海藻酸盐、果胶酸盐和卡拉胶等常用于回收食品蛋白 某些金属离子可与蛋白质分子上的某些残基发生相互作用而使蛋白质沉淀。例如，Ca2+和Mg2+能与羧基结合，Mn2+和Zn2+能与羧基、含氮化合物(如胺)以及杂环化合物结合。,非离子型聚合物沉淀法,降低水化度，使蛋白质沉淀。PEG的优点是无毒，不可燃烧，且对大多数蛋白质有保护作用，最常用的PEG是4000、6000和20000，所用的PEG浓度通常小于20%浓度，再高，会使粘度增大，造成沉淀的回收比较困难。蛋白质溶解度与PEG浓度之间的关系,式中S为PEG存在是的溶解度，So为无PEG时的溶解度，K是常数，与蛋白质和分子量的大小有关。,六、思考题,1、盐析沉淀中KS分段盐析和分段盐析有何区别？2、饱和(NH4)2SO4溶液怎样配制？在25时，在每升溶液中加入767克硫酸铵克达到100%饱和度。怎样使溶液达50%饱和度？3、含25%硫酸铵饱和度的蛋白质溶液150ml,须加多少克硫酸铵或多少毫升饱和硫酸铵溶液，才能使其达55%饱和度？4、盐析和有机溶剂沉淀在机理上有和异同，在操作上应注意那些问题？,稍息,稍息,
