《生物分离工程第五章层析.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物分离工程第五章层析.ppt（74页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、层 析,主讲：杨丽芬,起源 1903年，俄国的植物学家茨维特（Tsweet）提出。1901年的时候开始研究色谱现象。1903年，他将植物叶子的石油醚提取液倒入到填装CaCO3的玻璃管内，用纯净的石油醚淋洗，产生了不同的色带，她们分别为胡萝卜素、叶黄素、和叶绿素A。所以称之为色谱法（层析）。层析技术的特点 分离精度高、设备简单、操作方便，在物质成分的定量分析、检测、制备分离与纯化方面应用广泛，是下游技术加工过程中最重要的纯化技术之一。,层析的原理据混合物中，溶质在互不相溶的两相之间分配行为的差别，引起移动速度的不同而进行分离的方法。互不相溶的两相分别称为固定相和流动相，固定相填充于柱中，在柱的顶
2、端加入一定量的料液后，连续输入流动相，料液中的溶质在固定相和流动相中发生扩散传质，产生分配平衡。分配系数大的溶质在固定相上存的几率大，随流动相移动的速度小；分配系数小的溶质在固定相上存的几率小，随流动相移动的速度大。在层析柱出口，各溶质浓度随时间的变化图称作洗脱曲线。,层析的分类 按流动相的相态：气相层析法、液相层析法、超临界流体层析法。固定相可以是固体、液体、以固体为载体的液体薄层。生物物质一般在水溶液中，故生物分离一般采用液相层析法。按固定相形状：液相层析分为纸层析、薄层层析、柱层析。纸层析和薄层层析主要用于分析（定性或定量），柱层析主要用于制备分离。按操作压力：以固体为固定相的液相层析又
3、分为低压（0.5MPa）、中压（0.54MPa）、高压（440MPa）,按流动相的流向：轴向流层析和径向流层析。轴向流层析：流动相从固定相的一端输入，沿轴向流向另一端。应用普遍。径向流层析：柱心设一通透性细管，料液及流动相从柱的周围引入，从外表面沿径向流向柱心，透过中心管流出。优点：规模放大时半径不变，通过增大柱高提高处理能力，增加柱高不会增加压降，溶质浓度的分布较轴向流层析均匀，对固定相的机械强度要求不大，更适合大规模的分离过程。缺点：设备造价高。,径向流层析操作示意图,按分离操作方式：洗脱层析、迎头分析、顶替展开。洗脱层析：根据料液中的溶质在固定相和流动相间 分配行为的不同，在层析柱出口被
4、展开形成相互分离 的层析峰。迎头分析：与一般的固定床吸附操作相同，大量料液 连续输入到层析柱中，直到在出口处发生溶质穿透，只有最先穿透的组分能以纯粹的状态得到部分回收，之后流出液均为双组分或双组份以上的混合物。顶替展开：流动相中含有与固定相的亲和力比料液中 各组分都大的物质（顶替剂），顶替剂将料液中的所含溶质按其与固定相亲和力的大小不同从柱中次序顶替（洗脱）出来。顶替展开法可使区带得到浓缩，适于大量处理稀溶液。,据溶质和固定相之间的相互作用机理分：凝胶过滤层析、离子交换层析、反相层析、疏水作用层析、亲和层析。层析过程的理论基础？平衡模型该模型假定层析柱中不存在传质阻力、纵向扩散，溶质在两相中的
5、分配瞬间达到平衡。根据分配平衡和物料平衡对色谱过程进行处理，得出了洗脱时间（tR）和洗脱体积（VR）的公式。,当分配平衡符合线性关系时，Vo为孔隙体积，H为层析柱内固液体积之比。该模型很粗略，初步揭示了物质在色谱柱内的迁移过程，非线性分布等温线也能比较好的解释不对称色谱峰，特别是拖尾色谱的成因。但其理论假设和数学处理都很简单，仅能显示线性分配平衡情况下柱内层析带的平均移动速度和柱内洗脱峰的平均停留时间，不能阐明色谱流出曲线方程，实际应用价值有限。但它为色谱理论的发展提供了有益指导。,理论板模型（塔板理论）1941年，Martin和Synge提出的，他们把色谱柱设想成许多液-液萃取单元。基本假设
6、：色谱柱内径和柱内填料填充均匀，色谱柱由若干小段组成，这样一小段被称为一个理论塔板。每一小段的高度为理论板当量高度（HETP），塔板一部分为固定相占据，另一部分为流动相占据，且各塔板的流动相体积相等，称为板体积，以表示。层析柱中理论板的数目为N；层析柱的高度为L。,每个塔板内溶质在两相瞬间达到平衡，纵向分子扩散可以忽略。溶质在各塔板上的分配系数为一常数，分子纵向扩散可以忽略。流动相通过色谱柱不是连续的，而是脉冲式的间歇过程。每次进入和从一塔板转移到另一塔板的流动相体积均为Vm。,Vm,Vm,Vm,dQ,dQ,dQ,dQ,cm，n-2,cm，n-1,cm，n,cs，n-2,cs，n-1,cs，n
7、,n-2,n-1,n,理论板模型示意图,对于第n段理论板：Cs,n=m Cm,n 流动相流入微分体积dQ时，溶质在第n段的物料横算式：,（cm，n-1cm,n）dQ=,V0,N,dcm,n,Vt,V0,N,dcs,n,系统中只有流动相流动时，达到出口所需的时间：=L/u 将、代入得：若进料时间为t0，料液中溶质的浓度为C0，tt0后输入不含溶质的流动相，则式子的初始和边界条件为：当料液量很小式，可认为料液为脉冲输入，上式为洗脱曲线，呈Poisson分布（泊松分布）。若果N值很大，则溶质的洗脱曲线可用Gauss分布（正态分布）近似，即,其中,或,说明，理论板数越多，洗脱峰越窄，溶质之间的分离程度
8、越好，利用实测的洗脱峰和式子可计算层析柱的理论板数。,理论板模型仅用一个理论板数描述层析柱的分离性能，使用方便，特别适合于料液浓度很低的分析过程。但是，理论板模型不能确定层析柱的分离性能的影响因素，特别对于料液浓度较高的制备分离过程。轴向扩散模型 考虑到溶质在流动向和固定相间的传质速率及流动向的流动状态。该模型假设固定相为均质球形颗粒，溶质在固定相内无对流运动，利用均质固相模型进行物料衡算，最后求出：,从图上可知，存在某一流速使HETP最小，在此流速下塔板理论数最大，分离效果最好。在液相层析的操作条件下，一般分子扩散的影响可忽略不计。因此，为提高分离效果，可通过降低流速或减小固定相粒径来降低H
9、ETP，提高理论板数。由于减低流速意味着增加分离时间，故采用减小粒径的方法可同时保证分离操作的速度和高精度，这是高效液相层析的理论基础。很短的层析柱具有很大的理论板数，对高速度和高精度的分析非常有利。,分离度？又称为分别率。表示两个相邻的洗脱峰之间的距离与两个缝宽的代数平均值之比。通过增大峰间距离或降低缝宽可提高溶质之间的分离度。容量因子（k）固定相和流动相间溶质分配量之比。选择性（）洗脱峰相邻的两种溶质的容量因子之比。,Rs1时，溶质的分离已经较好。一般把Rs值应在11.3之间,假定曲线呈高斯分布，将平均洗脱时间和底线处切线缝宽的公式代入分离度的公式得：对于两个相邻的洗脱组分，假定洗脱缝宽和
10、分配系数近似相等，即W1=W2，m1=m2，上式简化：将塔板数的公式代入得：,将容量因子的公式代入得：分离度随着理论塔板数的增大而增大，当两种溶质的分配系数（容量因子）相差较小时，需要较多的理论板数才能获得较大的分离度。,凝胶过滤层析（Gel filtration chromatography，GFC）1.原理与操作用凝胶粒子为固定相，根据料液中溶质相对分子质量的差别进行分离的液相层析法。相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，移动速度快；所以首先流出。相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在
11、向下移动过程中，因此流程较长，移动速率慢；所以最后流出。,中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。,图3-1 凝胶层析分离原理示意图,基本概念外水体积、内水体积、柱床体积、洗脱体积 外水体积（Vo）是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的积。内水体积（Vi）是指凝胶颗粒中孔穴的体积。柱床体积 是（Vt）凝胶柱所能容纳的总体积。,GFC的洗脱曲线,洗脱体积（Ve）是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。它
12、包括自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的体积。Ve一般是介于Vo 和Vt之间的。对于完全排阻的大分子由于其不进入凝胶颗粒内，故其洗脱体积：Ve Vo 对于完全渗透的小分子由于它可以存在于凝胶柱整个体积内，故其洗脱体积：Ve Vt分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之间。,洗脱体积的测定？外水体积（Vo）：可以通过测定完全排阻的大分子物质的洗脱体积来测定，一般常用蓝色葡聚糖-2000作为测定外水体积的物质。内水体积（Vi）：可以通过测定完全渗透的小分子溶质（如重铬酸钾）的洗脱体积来测定 即 VeVoVi 推出 Vi Ve Vo柱床体积（Vt）：1)可用下式计算：Vt（D/
13、2）2h 2）根据 VtVoVi Vs 可以得到 3）加入一定量的水至层析柱预定标记处，然后测量水的体积。,对某物质在凝胶柱内洗脱体积Ve、Vo和Vi之间的关系可用下式表示：VeVomVi m为每个溶质分子在流动相和固定相之间的一个特定的分配系数。m可通过实验由Ve、Vo和Vi求得。V0 VomVi Vt 推出0m1，所以GFC的分离精度有限。对于完全排阻的大分子 Ve Vo 故 m 0 对于完全渗透的小分子 Ve Vt 故 m 1,m,VeV0,Vi,但实际上，约有1/5的内水因溶剂化作用而呈水合状态，妨碍小分子的自由扩散。故实际上Ve小分子 Vo0.8Vi；当0ml时，意味着溶质分子只有部
14、分向凝胶颗粒内扩散，m愈大，进入凝胶颗粒内的程度愈大；m0.5时，其洗脱体积VeVo十0.5Vi。GFC中溶质的分配系数m只是相对分子质量、分子形状、和凝胶结构的函数，与洗脱液的pH和离子强度等物性无关，即在一般的层析操作条件下，相对分子质量一定的溶质的分配系数为一常数。GFC一般采用组成一定的洗脱液进行洗脱即恒定洗脱法。,2.凝胶过滤介质良好凝胶过滤介质的要求：亲水性高、表面惰性（不存在相互作用）；稳定性强，在较宽的pH范围及化学试剂中保持稳定；具有一定的孔径分布范围；机械强度高，允许较高的操作压力；常用的凝胶介质,机械强度高,半刚性凝胶，中压液相层析用,高压液相层析用,两者均具刚性结构,凝
15、胶的特性参数排阻极限：不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。如：Sephadex G50的排阻极限为30KD。分级范围：能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子质量范围。Sephadex G50：1.530KD。溶胀率：每克干凝胶所吸收的水分的百分数。溶胀率=100%（溶胀处理平衡后的重量）/干燥重量床体积：1g干燥凝胶溶胀后所占的体积。凝胶的床体积可用于估算装满一定体积的层析柱所需要的干凝胶量。凝胶粒径：多用筛目或微米表示。,孔隙体积：层析柱中凝胶之间孔隙的体积，用V0表示。用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定。3.影响分离特性的因素 HETP影响溶质的分离度，影响HE
16、TP的因素：线速度：流动相在轴向上的流动速度。料液体积料液浓度 根据分离原理来说，溶质的洗脱时间tR和HETP与料液的浓度无关。实际操作中发现，当料液浓度较高时，洗脱曲线不对称，出现吐舌和拖尾，甚至出现分裂的两个峰，原因使料液和流动相的粘度差引起的。经验表明料液和流动相的粘度比需要小于2。,排阻极限极小,排阻极限很大,分子扩散引起急速下降,用无因此进料时间表示料液体积,相对分子质量与分配系数的关系m是判断分离效果的一个重要参数，同时也是测定蛋白质分子质量的一个依据。对于某一型号的凝胶，在一定的分子质量范围内，各个组分的m与其分子质量的对数成线性关系：m blgMr+c 由于Ve 和m也成线性关
17、系所以同样有：Ve blgMr+c通过将一些已知分子质量的标准蛋白质在同一凝胶柱上以相同条件进行洗脱，分别测定Ve 或m，并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然后在相同条件下测定未知样品的Ve 或m，通过标准曲线即可求出其分子质量。,凝胶粒径 通过减小粒径，不仅可以降低HETP，还可以提高分离速度。4.GFC的应用、特点生物大分子的纯化分子量测定脱盐及去除小分子杂质去热源物质 溶液的浓缩,凝胶层析操作简便，所需设备简单。有时只要有一根层析柱便可进行工作。分离介质凝胶完全不需要像离子交换剂那样复杂的再生过程便可重复使用。分离效果较好，重复性高。最突出的是样品回收率高，接近100。分离条件缓和。凝胶
18、骨架亲水，分离过程又不涉及化学键的变化，所以对分离物的活性没有不良影响。应用广泛。适用于各种生化物质，如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。分离的分子量范围也很宽，如Sephadex G类为102105d；Sepharose类为105108d。,离子交换层析 利用离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间的静电相互作用力的差别进行溶质分离的洗脱层析方法。1.原理与操作 荷电溶质在离子交换剂上的分配系数可用下式：I 为流动相的离子强度，A和B为常数，m为离子强度无限大时溶质的分配系数，是静电相互作用以为的非特异性吸附引起的溶质在离子交换剂上的分配。,蛋白质的
19、分配系数对离子强度非常敏感，即离子强度的微小变化，会引起分配系数的很大变化。同一离子强度下不同的蛋白质的分配系数可能相差很大。如果采用离子强度不变的流动相进行洗脱，两种蛋白质的洗脱体积相差很大，甚至分配系数大的蛋白质很难得到洗脱，造成洗脱剂的大量消耗和洗脱时间的大幅度增加。所以，IEC很少采用恒定洗脱，多采用流动相离子强度线性增大的线性梯度洗脱法和离子强度阶段改变的逐次洗脱法。线性洗脱过程中，流动相的离子强度线性增大，溶质的分配系数连续降低，移动速度逐渐增大。线性洗脱可通过改变离子强度的增大速度（浓度梯度），调整溶质的洗脱体积，即溶质洗脱峰间的距离，改变分离度的同时缩短洗脱时间。,洗脱体积相差
20、很大，消耗大量的洗脱液及洗脱时间,逐次洗脱过程，流动相的离子强度阶段性增大，溶质分配系数的降低和移动速度的增大也是阶段性。如果流动相的阶跃速度很快，在每种离子强度下的洗脱时间都很短，逐次洗脱接近线性梯度洗脱，反之接近恒定洗脱。逐次洗脱介于恒定洗脱和线性洗脱之间。线性洗脱法 优点：流动相离子强度连续增大，不出现干扰峰，操作范围广。缺点：需要特殊设备调配浓度梯度。逐次洗脱法 优点：切换不同盐浓度的流动相溶液进行洗脱，不许特殊设备，操作简单 缺点：流动相不连续变化，容易出现干扰峰。,线性洗脱过程线性洗脱条件下，IEC柱内溶质区带的后部移动速度高于前部，即线性洗脱具有区带浓缩作用。由于轴向返混和传质阻
21、力的影响，溶质区带在洗脱过程中不短的分散。区带浓缩作用和分散作用达到一平衡时，区带将以一定的宽度向下移动，即达到准稳态。影响分离度的因素当离子强度梯度I/V一定时，分离度与柱高无关。柱高一定时分离度随离子强度梯度的降低而增大。分离度与介质粒径成反比，与流速的平方根成反比。,料液量对分离度的影响利用浓缩料液有利于在不影响分离度的前提下提高IEC柱的处理能力。,（7.5mg蛋白）（3.75mg蛋白）,逐次洗脱过程 如果盐浓度的阶跃合理，可以使目标溶质得到高度浓缩。不合理，盐浓度太高，会使许多溶质同时洗脱，造成分离失败。,A吸附,B完全脱附,相当于梯度非常大的线性梯度浓缩，溶质高度浓缩,相当于恒定洗
22、脱，区带宽度增大。,IEC的应用及特点GFC主要用于生物产物的初步纯化和中后期的脱盐，IEC则是蛋白质、肽、核酸等生物产物的主要纯化手段。料液处理量大，具有浓缩作用，可以在较高的流速下操作；应用范围广，优化操作条件可大幅度的提高分离的选择性，所需柱长较短；产品回收率高；商品化的离子交换剂种类多，选择余地大，价格远低于亲和吸附剂。IEC的操作变量远多用GFC，影响分离特性的因素非常的复杂，增加了过程设计和规模放大的难度。小型层析柱的实验数据一般不能用于规模放大。,聚焦层析(focusing chromatography)利用两性电解质分子间等电点的不同进行分离纯化的洗脱层析方法。利用在较宽pH范
23、围内具有缓冲作用的多缓冲离子交换剂为固定相，同时，利用在较宽pH范围内具有缓冲作用的多缓冲剂做流动相。当在层析柱内通入与柱内初始pH不同的多缓冲剂时，柱内pH缓慢改变，在轴向形成连续的pH梯度，使料液中的溶质依据各自的等电点或者吸附，或者洗脱，逐次向下移动，彼此间得到分离，该方法称之为聚焦层析。,层析聚焦过程示意图,柱内pH为pH0,用pHe的多缓存液洗脱,由于溶质区带后部的pH总是低于前部，所以区带后部总是先于前部移动，区带受到压缩，因此，层析聚焦有浓缩溶质的作用。多缓冲剂和多离子交换剂多缓冲剂是两性电解质缓冲剂，由相对分子质量大小不一的各种组分构成，每种构成成分均为多羧基和多氨基化合物，存
24、在各自的等电点。Pollybuffer 96 pH 96 Pollybuffer 74 pH7 4 Pharmalyte pH10.5 8,多缓冲离子交换剂可用普通的凝胶过滤介质偶联特殊的离子交换基制备。PBE118、94是以Sepharose 6B为载体阴离子交换剂。PBE118 配 Pharmalyte PBE 94 配 Pollybuffer 96、Pollybuffer 74 Mono P是一种弱碱性的阳离子交换剂，可与上述三种缓冲液相配。层析聚焦的应用 生化实验室规模的样品制备或成分分析。,疏水作用层析(hydrophobic chromatography)利用固定相载体上偶联的疏水
25、性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离的方法，称之为疏水层析。疏水性吸附剂 各种凝胶过滤介质经偶联疏水性配基。常用的疏水性配基主要有苯基、短链烷基（C3C8）、烷氨基、聚乙二醇、聚醚等。,R代表疏水配基,影响疏水性吸附的因素离子强度及种类。蛋白质的疏水作用随离子强度的提高而增大，高价离子对疏水作用的影响强。破坏疏水作用的物质 SCN-，ClO4-和I-等离子半径较大、电荷密度低的阴离子可减弱水分子间的相互作用。表面活性剂 减弱蛋白质的疏水性。温度 吸附结合作用随温度的升高而增大。,HIC的特点由于高浓度盐溶液中疏水吸附作用增大，可直接分离盐析后的蛋白溶液。可通过调节疏水配基链长
26、和密度调节吸附力，可根据目标产物的特性选择适宜的吸附剂。疏水性吸附剂种类多，选择余地大，价格与离子交换剂相当。,反向层析(reverse phase chromatography，RPC)利用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，根据溶质的极性（疏水性）的差别进行溶质分离纯化的洗脱层析法，称之为反相层析。RPC中溶质通过疏水性相互作用分配于固定相，但RPC固定相表面完全被非极性基团所覆盖，表现强烈的疏水性。因此，必须采用极性有机溶剂（甲醇、乙腈）或其水溶液进行溶质的洗脱分离。RPC主要应用于相对分子质量低于5000，特别是1000以下的非极性小分子物质的分析和纯化，也可用于蛋
27、白质等生物大分子的分析和纯化。,溶质在反相介质上的分配系数取决于溶质的疏水性。一般疏水性越大，分配系数越大。RPC多采用降低流动相极性的（含水量）的线性梯度洗脱法。反相介质以硅胶为载体，通过硅烷化反应在硅胶的表面键合非极性分子层制备。R1和R2多为甲基，R为C4、C8、C18烷基或苯基。其中利用C18硅烷化制备的反相介质最多，通称ODS。,高分子聚合物也可作为反相介质的载体 TSK gel Octadecy1-4PW TSK gel Octadecy1-NPR（聚丙烯酸酯C18）反相介质性能稳定，分离效率高，可分离蛋白质、肽、氨基酸、核酸、甾类脂类、脂肪酸、糖类、植物碱。RPC作为定量分析手段
28、，广泛应用于科学研究、临床诊断、工业检测、环保等各行业。作为产品纯化制备手段，由于反相介质与其分离的对象比价格较高，多限于实验室规模的应用。,羟基磷灰石层析（hydroxyapatite,HAP）羟基磷灰石是一种磷酸钙晶体，基本分子结构 Ca10(PO4)6(OH)2。HAP的表面存在两种不同的吸附晶面，各存在吸附点C点和P点，前者起阴离子交换作用，后者起阳离子交换作用。当在中性环境下，酸性蛋白质主要吸附于C点，碱性蛋白主要吸附于P点，利用磷酸缓冲液（K2HPO4和KH2PO4）为流动相洗脱展开时，磷酸根离子在C点竞争性吸附，交换出酸性蛋白；K+在P点竞争吸附，交换出碱性蛋白质。所以，HAP层
29、析通常以磷酸盐缓存液为流动相，采用提高盐浓度的线性洗脱法。,HAP晶体可用于识别DNA和RNA的单链和双链，分离IEC和HIC难于分离的蛋白质物系，分辨率更高。如：人肿瘤坏死因子，用IEC法、高效RPC法和电泳法只得到一个洗脱峰，而用HAP层析可得到四个洗脱峰。HAP吸附剂价格便宜，远低于离子交换剂，适用于大规模的分离纯化过程，已经成为纯化单克隆抗体的主要手段。,灌注层析(perfusion chromatography)灌柱层析是美国Perseptive Biosystems公司开发的层析分离技术。灌柱层析的关键是以POROS命名的固定相粒子的特殊结构：基质是聚苯乙烯-二乙烯苯，含有两种大小
30、不同的孔道。大孔径的直径为0.6-0.8m，流体以对流形式通过，称为穿透孔。小孔径与一般介质一样，流体扩散的形式通过，称为扩散孔。穿透孔之间以扩散孔相连。,灌柱层析的流速一般较高，500-5000cm/h，在此范围内，HETP仅是粒径的函数与流速无关，所以高流速下操作不影响柱效。超过上述范围，HETP随流速的增大而增大。灌柱层析最大的特点是分离速度快。,超临界流体层析超临界流体色谱(supercritical fluid chromatography,SFC)是以超临界流体(SF)作为流动相的色谱分离模式。SFC以其流动相的特殊性质而在分离分析领域占有一席之地，可作为气相色谱（GC）和高效液相
31、色谱（HPLC）的重要补充技术。利用超临界流体作为流动相在固定相上分配，可提高溶质在固定相中的扩散速率，提高分离速度和柱效。由于超临界流体的溶解能力随压力的升高而增大，即压力升高，溶质在固定相上的分配系数降低，所以，SFC采用增大压力的压力梯度洗脱法。,也可以与其他溶剂混合使用，采用改变溶剂浓度（极性）的浓度梯度洗脱法。因操作在高压下进行，所以，分离产物的回收也须采用高压容器特点：SFC既可分离GC不适应的高沸点、低挥发性的样品，又比HPLC具有更快的分离速度和柱效率。其应用领域非常广泛，可用于分离分析热敏性物质、非挥发性高分子、生物大分子、极性物质和手性对映体等。,亲和纯化生物亲和作用：生物
32、分子能够区分结构和性质非常相近的其他分子，选择性的与其中某一种分子结合，生物分子的这种特异性相互作用，具有排他性。亲和纯化技术：利用生物分子间的特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术。亲和作用不只限于生物物质之间，Na+和Cl-之间的静电相互吸引的作用也是一种亲和作用，只是生物分子之间的亲和作用具有更高的选择性。蛋白质等分子产生亲和作用：一是结构是互补（具有钥匙和锁孔的关系），二是分子及原子水平的各种作用（静电作用、氢键、疏水性相互作用、配位键、弱共价键等）。,影响亲和作用的因素离子强度：如果亲和作用主要源于静电引力，则提高离子强度无疑会减弱或完全破坏亲和作用pH：当静电引力对亲和作用
33、贡献大时，pH值严重影响亲和作用。抑制氢键形成的物质温度：温度升高减弱静电作用、氢键、金属配位键作用，但可提高疏水作用。SCN-，I-和ClO4-等离子半径较大的存在，降低疏水作用。螯合剂：当亲和作用源于亲和分子对金属离子形成的配位键时，加入EDTA等螯合剂除去金属离子，可使亲和作用消失。,常见的亲和作用体系 酶-底物；酶-底物的竞争性抑制剂；抗原-抗体；激素-受体；DNA与互补DNA或RNA；维生素和它的特异结合蛋白、糖蛋白与它相应的植物凝集素等。亲和层析亲和层析是利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离目的的一类特殊层析技术。,可亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不
34、溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含有混合组份的样品通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出，然后改变流动组成份，将结合的亲和物洗脱下来。亲和层析中所用的载体称为基质，与基质共价连接的化合物称配基。,亲和层析纯化过程简单、迅速，且分离效率高。对分离含量极少又不稳定的活性物质尤为有效。但本法必须针对某一分离对象，制备专一的配基和寻求层析的稳定条件，因此亲和层析的应用范围受到了一定的限制。亲和层析可用于纯化生物大分子：稀溶液的浓缩；不稳定蛋白质的贮藏；从纯化的分子中除去残余的污染物；用免疫吸附剂吸附纯化对此尚无互补配体的生物大分子；分离核酸是亲和层析应用的一个重要方面。,
